遺伝子スイッチが緑膿菌表面コロニー形成を制御する | 遼寧海岸ワイズパートナーズ株式会社

Nature Microbiology (2023)この記事を引用

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粘膜表面の効率的な定着は、緑膿菌のような日和見病原体にとって不可欠であるが、細菌が集団的および個別にどのように適応して付着、毒性、拡散を最適化するのかはほとんど不明である。今回我々は、確率的遺伝スイッチである hecR-hecE を同定した。このスイッチは二峰性に発現し、機能的に異なる細菌部分集団を生成して、緑膿菌の増殖と表面での分散のバランスをとっている。 HecE はホスホジエステラーゼ BifA を阻害し、ジグアニル酸シクラーゼ WspR を刺激して c-di-GMP セカンドメッセンジャーレベルを増加させ、細胞亜集団の表面コロニー形成を促進します。低レベルの HecE 発現細胞は分散します。 HecE+ 細胞の割合はさまざまなストレス因子によって調整され、バイオフィルム形成と表面成長コミュニティの長距離細胞分散の間のバランスを決定します。また、HecE 経路が緑膿菌の表面コロニー形成に効果的に対抗するための創薬可能な標的であることも実証します。このような二元状態を明らかにすることで、主要なヒト病原体による粘膜感染を制御する新しい方法が開かれます。

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この研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。配列決定実験を伴うクロマチン免疫沈降の生の配列決定ファイルは、NCBI からアクセッション番号 PRJNA900431 でアクセスできます。独自の生物学的材料は、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 BifA R 状態二量体の構造座標は、アクセッション番号 8ARV で PDB ライブラリに寄託されています。

フローサイトメトリーデータの分析用に生成されたコードは、https://github.com/Jenal-Lab からアクセスできます。

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クローン作成にご協力いただいた F. Hamburger (バーゼル大学 Biozentrum) に感謝します。ファージの単離と特性評価に対する支援については、E. Maffei と A. Harms (バーゼル大学バイオゼントルム) に感謝します。この研究は、CM への Biozentrum PhD Fellowship、スイス国立科学財団 (UJ への助成金番号 310030_189253)、スイス国立科学財団によって資金提供された NCCR AntiResist (KD および UJ への助成金番号 51NF40_180541)、欧州研究評議会によって支援されました。 (KD への助成金番号 716734)、および Sygeforsikring Danmark、Danish Innovation Fund、Novoseed から MG および TT-N への助成金。

ティナ・イェーガー

現在の住所: バーゼル大学生物医学部門、バーゼル、スイス

ジェイコブ・G・マローン

現在の住所: 分子微生物学部門、ジョン・イネス・センター、ノリッジ、英国

Biozentrum、バーゼル大学、バーゼル、スイス

クリスティーナ・マナー、ラファエル・ディアス・テイシェイラ、ディビア・サハ、アンドレアス・カチュマルチク、ラファエラ・ゼンプ、ファビアン・ウィス、ティナ・イェーガー、ブノワ=ジョセフ・ラヴェンティ、ジェイコブ・G・マローン、セバスチャン・ヒラー、クヌート・ドレッシャー、ウルス・ジェナル

sciCORE、科学コンピューティングセンター、バーゼル大学、バーゼル、スイス

セバスチャン・ボワイエ

デンマーク工科大学化学科、リンビー、デンマーク

カトリーヌ・クヴォルトルップ

コスタートンバイオフィルムセンター、コペンハーゲン大学、コペンハーゲン、デンマーク

イェンス・ボー・アンデルセン、マイケル・ギブスコフ、ティム・トルカー＝ニールセン

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概念化: CM、TJ、UJ 方法論: CM、RDT、DS、AK、RZ、TJ、B.-JL、JGM、JBA、MD、TT-N.、KQ、KD、UJ 形式分析: CM、RDT、SB調査：CM、RDT、DS、RZ、TJ、JGM、FW、JBA 執筆（原案）：CM、UJ 資金調達：MG、TT-N.、KD、KQ、SH、UJ 監修：SH、KDそしてUJ

ウルス・ジェナルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた Tim Rick、Daniel Wozniak、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、hecR::Tn 変異体のコロニー形態。 b、WTおよびhec欠失株のコロニー形態。実験は三重に行われました。代表的な画像を1枚示します。 c、緑膿菌 WT および hec 欠失株の増殖。平均値と 3 つの生物学的反復 (それぞれ 6 つの技術的反復) の標準偏差。ｄ、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター（ＥＶ、対照プラスミド）からのｈｅｃ遺伝子の発現のためのプラスミドを含むＷＴ株およびｈｅｃ欠失株の増殖。 LB (破線) または 100 μM IPTG を添加した LB (実線) での増殖を記録し、3 つの生物学的反復 (それぞれ 3 つの技術的反復) の平均値と標準偏差を示します。 e、緑膿菌WT、およびIPTG誘導性プロモーターからhecEを発現するPelまたはPslエキソ多糖を欠く変異体のコロニー形態。実験は三重に行われました。代表的な画像を1枚示します。

ａ、ＢｉｆＡドメイン構造の概略図、およびＨｅｃＥと特異的に相互作用することがＹ２Ｈによって同定されたＢｉｆＡフラグメント（ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＳＩＤ、最小相互作用ドメイン）。 b、AlphaFold によって予測された、細胞質膜 (灰色) に埋め込まれた BifA 二量体の三次元構造。 c、HecEのCoIP-MS分析。免疫沈降実験は、PAO1 WT 株、または C 末端 FLAG タグ付き HecE および抗 M2 結合磁気ビーズを発現する株を使用して実行されました。ビーズ上に保持されたタンパク質を質量分析法を使用して分析しました。 3 つの生物学的複製から得られたデータは、火山プロットとして示されています。 HecE-Flag と WT (ctrl) の間で検出されたペプチドの Log2 変換された強度比を計算し、有意性分析 (修正 t 統計、経験的ベイズ法 59) から得られた値に対してプロットしました。 d、空のプラスミド（EV）またはIPTG誘導性プロモーターからhecEを発現するプラスミドを含む緑膿菌野生型および変異株のコロニー形態。実験は三重に行われました。代表的な画像を1枚示します。 e、プラスミドコントロール（EV）またはc-di-GMPを発現するプラスミドを保有する緑膿菌野生型（WT）、hecR::TnおよびΔbifA株の増殖（上）および蛍光（c-di-GMPレベル、下）。 di-GMP センサー cdGreen。 2 つの生物学的反復 (それぞれ 6 つの技術的反復) の平均値と標準偏差が示されています。

a、hecR の発現により、HecR および HecE レベルが上昇します。 hecR または hecE の染色体 Flag タグ付きコピーを発現する株における HecR および HecE の免疫ブロット分析。株には、アラビノース誘導性プロモーターからの hecR、hecE、または両方の遺伝子を発現するプラスミドが含まれていました (EV、コントロールプラスミド)。誘導因子アラビノースの存在下 (+) または非存在下 (-) で増殖させた細胞の抽出物を、抗 Flag を用いた免疫ブロッティングによって分析しました (n = 1)。 b、HecR は hecRE プロモーター領域に結合します。 EMSA アッセイは、示されているように、hecRE プロモーター領域を含む標識 DNA と精製 HecR タンパク質の濃度を増加させて実行されました (n = 2)。 c、HecR は緑膿菌染色体上の hecRE 遺伝子座にのみ結合します。クロマチンプルダウン実験は、染色体野生型 hecR コピーの非存在下で hecR の HA タグ付きコピーを発現する株と HA 特異的抗体を用いて行われました。配列決定リードは、緑膿菌染色体全体 (上) または hecRE 遺伝子座 (下) について y 軸上にプロットされています。グラフは、Biomatters によって作成された Geneious バージョン 2019.0 を使用して生成されました。 d、hecEを発現する細胞の割合は、緑膿菌の増殖中に変化します。 IPTG誘導性プロモーター（EV、コントロールプラスミド）からhecR、hecE、または両方の遺伝子を発現するプラスミドを含むhecRE-2mRレポーター株の増殖中に、光学濃度（実線）および蛍光（hecE発現、破線）を記録しました。平均値と標準偏差は、それぞれ 3 つの技術的反復を含む 3 つの生物学的反復について示されています。 e、hecREを発現する細胞の画分は培地に依存しません。 hecRE-2mR 染色体レポーターを保有する緑膿菌野生型を、指定の培地で 20 時間培養しました。フローサイトメトリーデータの定量化は、3 つの生物学的複製について示されています。トリプリケートは独立してフィッティングされました。計算値の平均値と範囲が表示されます。平均の正規性はシャピロ・ウィルク検定を使用してチェックされました（P < 0.05）。一元配置分散分析検定を使用して母平均の差を分析し (P < 0.05)、その後 Tukey の HSD 事後検定を使用して、調整された P 値を示しました。 f、hecREを発現する細胞の割合は、緑膿菌の増殖中に変化します。 IPTG誘導性プロモーターからhecRを発現するプラスミドを保有するhecRE-2mRレポーター株を新鮮なLBに希釈して戻し、12時間培養した(EV、対照プラスミド)。フローサイトメトリーで測定したレポーターの蛍光強度はバイオリンプロット（左y軸）として示され、増殖は点描線（右y軸）で示されます。示された閾値（灰色の線）よりも高いシグナル値を有する細胞を、hecRE-2mRを発現する細胞として計数した。 g. hecRE の発現は栄養制限に応答します。緑膿菌 hecRE-2mR レポーター株を、唯一の炭素源として異なる量のコハク酸塩を含む MOPS 最少培地で培養しました。 hecREを発現する細胞の増殖および画分は図3fのように示されています。 h、i、示された量のコハク酸塩を含むMOPS中で37℃で培養した、ΔrsmA（h）およびΔrpoS（i）変異体におけるhecRE-2mRレポーターのフローサイトメトリーデータ。 PAO1野生型株よりも高い蛍光強度を有する細胞を定量した(右軸)。フローサイトメトリー前の培養物の光学密度を点描線で示します（左軸）。 j、hecR の異所性発現は、定常期にのみ hecE 転写を誘導します。野生型 (WT) および示された変異体における hecRE-2mR レポーターを有する株のフローサイトメトリー分析。 hecR を発現するプラスミドを含むレポーター株を、100 μM IPTG を補充した LB 中で対数期または 20 時間 (静止) 培養しました。フローサイトメトリー実験は 3 つの生物学的複製について示されており、個々のヒストグラムがグラフに積み上げられています。 k、hecREを発現する細胞の割合は、温度が上昇すると増加します。 IPTG誘導性プロモーターからhecRを発現するプラスミドを保有する緑膿菌hecRE-2mRレポーター株を、示されているように温度を上昇させながら、100μM IPTGを補充したMOPS + 20 mMコハク酸塩中で培養しました（EV、対照プラスミド）。フローサイトメトリー実験は 3 つの生物学的複製について示されており、個々のヒストグラムがグラフに積み上げられています。 l、aに示すイムノブロットのトリミングされていないスキャン。 m、フローサイトメトリー実験に使用されるゲーティング戦略。 hecRE-2mR レポーターを保有する野生型の 3 つの複製のうちの 1 つを示します。

a、d、緑膿菌野生型および変異株のバイオフィルム量の増加。 BiofilmQ70 を使用してバイオフィルムを一辺の長さ 2.34 μm の立方体に分割し、バイオフィルムの体積を任意の時点での個々の立方体すべての合計として計算しました。赤い線は飛散現象の開始を示します。 1 つの実験の分析が各パネルに表示されます。 b、e、バイオフィルム境界までの距離（解像度、20ボクセル）、蛍光強度、局所細胞密度などのオブジェクトパラメーターは、BiofilmQを使用して計算されました。 c、f、分散イベントの開始時の蛍光強度（赤い線）がプロットされ、バイオフィルム境界までの距離に応じて色分けされています。

a、図5aに示す添付ファイルデータの平均の標準偏差。 b、IPTG誘導性プロモーターから大腸菌ジグアニル酸シクラーゼdgcZを発現するプラスミドとクミン酸誘導性プロモーターからさまざまなbifA対立遺伝子を発現するプラスミドを保有するWT株と変異株のマイクロタイタープレートベースの付着（EV、対照プラスミド）。 BifA 発現は誘導されませんでしたが、dgcZ 発現は 100 μM IPTG で誘導されました。 H6-335-P1 を指定の濃度で添加しました。 9.5時間後に付着を定量化した。 2 つの生物学的複製の平均値が示されています。 c、R状態(PDB: 4LYK)およびT状態(PDB: 4LJ3)におけるPdeL二量体のα6およびα5'の配置。活性部位の残基および T 状態の立体構造の安定化に関与する残基が強調表示され、棒表示として表示されます。 d、R-(PDB: 8ARV)およびモデル化されたT状態におけるBifA二量体のα6およびα5'の配置。活性部位の残基と、T 状態の立体構造を安定化すると仮定される保存残基が強調表示され、棒表示として示されています。 e、f、それぞれ図5d、eに示す添付ファイルデータの平均の標準偏差。

SCV画面

酵母ツーハイブリッドスクリーニング

SCVサプレッサースクリーン

構造データの収集と詳細化統計

hecE を発現する緑膿菌細胞は、バイオフィルム分散後も付着したままになります。

フローチャンバーで増殖させたバイオフィルムからの細胞の分散は、高度に調整されたプロセスです。

HecE を欠く変異体は、細胞分散後に成熟したバイオフィルムを維持できません。

BifA を欠く変異体では、早期のバイオフィルム形成と細胞分散が起こります。

WspR を欠く変異体は、細胞分散後に成熟したバイオフィルムを維持できません。

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転載と許可

Manner, C.、Dias Teixeira, R.、Saha, D. 他遺伝子スイッチが緑膿菌の表面定着を制御します。ナットマイクロバイオル (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01403-0

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受信日: 2022 年 10 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 5 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01403-0

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