banner
ニュース センター
特注品も承ります。

遺伝子スイッチが緑膿菌表面コロニー形成を制御する

Jun 04, 2023

Nature Microbiology (2023)この記事を引用

70 アクセス

16 オルトメトリック

メトリクスの詳細

粘膜表面の効率的な定着は、緑膿菌のような日和見病原体にとって不可欠であるが、細菌が集団的および個別にどのように適応して付着、毒性、拡散を最適化するのかはほとんど不明である。 今回我々は、確率的遺伝スイッチである hecR-hecE を同定した。このスイッチは二峰性に発現し、機能的に異なる細菌部分集団を生成して、緑膿菌の増殖と表面での分散のバランスをとっている。 HecE はホスホジエステラーゼ BifA を阻害し、ジグアニル酸シクラーゼ WspR を刺激して c-di-GMP セカンド メッセンジャー レベルを増加させ、細胞亜集団の表面コロニー形成を促進します。 低レベルの HecE 発現細胞は分散します。 HecE+ 細胞の割合はさまざまなストレス因子によって調整され、バイオフィルム形成と表面成長コミュニティの長距離細胞分散の間のバランスを決定します。 また、HecE 経路が緑膿菌の表面コロニー形成に効果的に対抗するための創薬可能な標的であることも実証します。 このような二元状態を明らかにすることで、主要なヒト病原体による粘膜感染を制御する新しい方法が開かれます。

これはサブスクリプション コンテンツのプレビューです。教育機関経由でアクセスできます

Nature およびその他の 54 の Nature Portfolio ジャーナルにアクセス

Nature+ を入手、最もお得なオンライン アクセス サブスクリプション

$29.99 / 30 日

いつでもキャンセル

このジャーナルを購読する

12 冊のデジタル号を受け取り、記事にオンラインでアクセスできます

年間 $119.00

1号あたりわずか9.92ドル

この記事をレンタルまたは購入する

必要なだけこの記事を入手してください

$39.95

価格にはチェックアウト時に計算される地方税が適用される場合があります

この研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 配列決定実験を伴うクロマチン免疫沈降の生の配列決定ファイルは、NCBI からアクセッション番号 PRJNA900431 でアクセスできます。 独自の生物学的材料は、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 BifA R 状態二量体の構造座標は、アクセッション番号 8ARV で PDB ライブラリに寄託されています。

フローサイトメトリーデータの分析用に生成されたコードは、https://github.com/Jenal-Lab からアクセスできます。

Rutherford, ST & Bassler, BL 細菌のクオラムセンシング: 毒性におけるその役割とその制御の可能性。 CSHの視点。 医学。 2、a012427 (2012)。

Google スカラー

Rahbari, KM、Chang, JC & Federle, MJ 連鎖球菌の菌数感知システムにより、自然免疫の抑制が可能になります。 mBio 12、e03400-20 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, L. & Luo, Y. 細菌の定数感知システムと腸内細菌と宿主のクロストークにおけるその役割。 フロント。 微生物。 12、611413 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ラベンティ、B.-J. 他。 表面誘導性の非対称プログラムは、緑膿菌による組織定着を促進します。 細胞宿主微生物 25、140–152 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ディアード、M.ら。 無毒性表現型の発現による協調的毒性の安定化。 ネイチャー 494、353–356 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アッカーマン、M.ら。 表現型ノイズによって媒介される自己破壊的な協力。 Nature 454、987–990 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kotte, O.、Volkmer, B.、Radzikowski, JL & Heinemann, M. 大腸菌の中心炭素代謝における表現型双安定性。 モル。 システム。 バイオル。 10、736 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Basan、M.ら。 変動する環境における成長と遅れの間の普遍的なトレードオフ。 ネイチャー 584、470–474 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bakshi, S. et al. 増殖制御と持続性のためのアプリケーションを使用して、複雑で動的な環境で細菌の系統を追跡します。 ナット。 微生物。 6、783–791 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Balaban, NQ、Merrin, J.、Chait, R.、Kowalik, L. & Leibler, S. 表現型スイッチとしての細菌の持続性。 サイエンス 305、1622–1625 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Arnoldini, M.、Vizcarra, IA & Peña-Miller, R. サルモネラ菌における病原性遺伝子の双安定発現は、抗生物質耐性亜集団の形成につながります。 PLoSバイオル。 8、e1001928 (2014)。

記事 Google Scholar

Manina, G.、Griego, A.、Singh, LK、McKinney, JD & Dhar, N. DNA 損傷反応の既存の変動により、ストレス下での単一のマイコバクテリアの運命が予測されます。 EMBO J. 38、e101876 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stewart, MK、Cummings, LA、Johnson, ML、Berezow, AB & Cookson, BT 表現型の不均一性の制御により、サルモネラ菌は宿主のカスパーゼ-1 炎症反応を回避できます。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 108、20742–20747 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim、JM、Garcia-Alcala、M.、Balleza、E.、および Cluzel、P. 確率的転写パルスは大腸菌における鞭毛生合成を調整します。 科学。 上級 6、eaax0947 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アームブラスター、CRら。 表面センシングの不均一性は、緑膿菌の集団における分業を示唆しています。 eLife 8、e45084 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klockgether, J. & Tümmler, B. 病原体としての緑膿菌の理解における最近の進歩。 F1000リサーチ6、1261(2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kazmierczak, BI、Schniederberend, M. & Jain, R. シュードモナスの運動システムの相互調節: 鞭毛、線毛、病原性の密接な関係。 カー。 意見。 微生物。 28、78–82 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マローン、JG 他 YfiBNR は、緑膿菌における環状ジ GMP 依存性の小さなコロニー変異体の形成と持続を媒介します。 PLoS 病巣。 6、e1000804 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang、C.、Ye、F.、Kumar、V.、Gao、Y.-G. & 張、L.-H. BswR は、低分子 RNA rsmZ の調節を通じて緑膿菌における細菌の運動性とバイオフィルム形成を制御します。 核酸研究所 42、4563–4576 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wurtzel, O. et al. 体温で増殖させた緑膿菌の一塩基分解能トランスクリプトーム。 PLoS 病巣。 8、e1002945 (2012)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Sevin, EW & Barloy-Hubler, F. RASTA-Bacteria: 原核生物の毒素-抗毒素遺伝子座を特定するための Web ベースのツール。 ゲノムバイオル。 8、R155 (2007)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaczmarczyk、A. et al. 新しいバイオセンサーは、分化中の細胞における C-di-GMP の動的な変化を超高時間分解能で明らかにします。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.18.512705 (2022) でプレプリント。

ハリソン、JJ 他緑膿菌の鞭毛変異体におけるエキソ多糖レベルの上昇は、バイオフィルムの成長と慢性感染症に影響を及ぼします。 PLoS ジュネット。 16、e1008848 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Drifus、J.E. et al. Sia システムと c-di-GMP は、浮遊性緑膿菌における Psl の細胞結合の制御において重要な役割を果たします。 J.Bacteriol. 204、e0033522 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

クチマ、SL et al. 環状ジ GMP ホスホジエステラーゼである BifA は、緑膿菌 PA14 によるバイオフィルム形成と群れ運動性を逆に制御します。 J.Bacteriol. 189、8165–8178 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hickman, JW、Tifrea, DF & Harwood, CS 環状ジグアニル酸レベルの調節を通じてバイオフィルム形成を調節する化学感覚システム。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 102、14422–14427 (2005)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aldridge, P.、Paul, R.、Goymer, P.、Rainey, P.、Jenal, U. Caulobacter crescentus の極地発生における GGDEF 調節因子 PleD の役割。 モル。 微生物。 47、1695–1708 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アンダーセン、JB et al. 天然の c-di-GMP ホスホジエステラーゼの誘導により、緑膿菌バイオフィルムが分散します。 抗菌。 エージェント Chem. 65、e02431-20 (2021)。

記事 Google Scholar

McAdams, HH & Arkin, A. 遺伝子発現における確率的メカニズム。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 94、814–819 (1997)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ブレンシック、A.ら。 緑膿菌の GacS/GacA シグナル伝達系は、RsmY および RsmZ 調節性低分子 RNA の転写の制御を通じてのみ機能します。 モル。 微生物。 73、434–445 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Francis, VI、Stevenson, EC & Porter, SL 緑膿菌の毒性に必要な 2 成分系。 FEMS 微生物。 レット。 364、fnx104 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ワン、BXら。 ムチングリカンはセンサーキナーゼretsを介してシグナルを送り、緑膿菌の毒性関連形質を阻害します。 カー。 バイオル。 31、90–102 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Broder, UN、Jaeger, T. & Jenal, U. LadS は、緑膿菌において急性から慢性の病原性スイッチを誘導するカルシウム応答性キナーゼです。 ナット。 微生物。 2、16184 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

LeRoux, M.、Peterson, SB & Mougous, JD 細菌の危険感知。 J.Mol. バイオル。 427、3744–37​​53 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palmer, KL、Aye, LM、Whiteley, M. 栄養学的手がかりは、嚢胞性線維症喀痰における緑膿菌の多細胞挙動を制御します。 J.Bacteriol. 189、8079–8087 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sriramulu, DD、Lünsdorf, H.、Lam, JS & Römling, U. 微小コロニー形成: 嚢胞性線維症肺の緑膿菌の新規バイオフィルム モデル。 J.Med. 微生物。 54、667–676 (2005)。

論文 PubMed Google Scholar

入江由美ほか自己生成されるエキソ多糖は、緑膿菌のバイオフィルム形成を刺激するシグナルです。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 109、20632–20636 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アンダーセン、JB et al. c-di-GMPシグナル伝達を妨害し、緑膿菌バイオフィルムの分散を誘導する小分子の同定。 npj バイオフィルム マイクロバイオーム 7、59 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sundriyal、A. et al. EALドメイン触媒によるセカンドメッセンジャー環状ジGMPの加水分解の固有の制御。 J.Biol. 化学。 289、6978–6990 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reinders、A. et al. 大腸菌におけるc-di-GMPのデジタル制御は、集団全体の発生移行とファージ感受性のバランスをとります。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.10.01.462762 (2021) でプレプリント。

Kulesekara, H.、Lee, V. & Brencic, A. 緑膿菌のジグアニル酸シクラーゼとホスホジエステラーゼの分析により、毒性におけるビス-(3'-5')-サイクリック GMP の役割が明らかになりました。 手順国立Aacd。 科学。 USA 103、2839–2844 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

メロウグ、G.ら。 緑膿菌液体培養物中の異なるタイプの多細胞凝集体。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.05.18.492589 (2022) でプレプリント。

Roy, ​​AB、Petrova, OE & Sauer, K. ホスホジエステラーゼ DipA (PA5017) は、緑膿菌バイオフィルムの分散に不可欠です。 J.Bacteriol. 194、2904–2915 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Silva, JB、Storms, Z. & Sauvageau, D. バクテリオファージ吸着の宿主受容体。 FEMS 微生物。 レット。 363、fnw002 (2016)。

記事 Google Scholar

ハーベイ、H.ら。 緑膿菌は、IV 型線毛のグリコシル化を通じてファージから防御します。 ナット。 微生物。 3、47–52 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ackermann, M. 微生物における表現型の不均一性に関する機能的観点。 ナット。 Rev.Microbiol. 13、497–508 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ネバダ州ロウリー、L. マクナリー、WC ラトクリフ、SP ブラウン 分業、賭けのヘッジ、および混合バイオフィルム投資戦略の進化。 mBio 8、e00672-17 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Almblad, H. et al. 緑膿菌のサイクリック AMP-Vfr シグナル伝達経路は、サイクリック di-GMP によって阻害されます。 J.Bacteriol. 197、2190–2200 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

クラセカラ、BR 他。 c-di-GMP の不均一性は、鞭毛の運動性を調節する走化性機構によって生成されます。 eLife 2、e01402 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Burrows, LL 緑膿菌のけいれん運動性: IV 型線毛が作動中。 アンヌ。 Rev.Microbiol. 66、493–520 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

はあ、D.-G. & O'Toole、GA c-di-GMP とバイオフィルムの形成と分散に対するその効果: 緑膿菌のレビュー。 微生物。 スペクトル。 3、MB-0003-2014 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

Vrla、GDら。 細胞傷害性アルキルキノロンは、緑膿菌の表面誘発毒性を媒介します。 PLoS 病巣。 16、e1008867 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mulcahy、LR、Isabella、VM、および Lewis、K. 疾患における緑膿菌バイオフィルム。 微生物。 エコル。 68、1–12 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Siryaporn, A.、Kuchma, SL、O'Toole, GA & Gitai, Z. 表面付着は緑膿菌の病原性を誘発します。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 111、16860–16865 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Acar, M.、Mettetal, JT & van Oudenaarden, A. 変動する環境における生存戦略としての確率的スイッチング。 ナット。 ジュネット。 40、471–475 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Perkins、TJ & Swain、PS セルラー意思決定のための戦略。 モル。 システム。 バイオル。 5、326–326 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Neidhardt、FC、Bloch、PL&Smith、DF 腸内細菌用の培地。 J.Bacteriol. 改訂 119、736–747 (1974)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マッフェイ、E.ら。 BASEL ファージ コレクションを使用した大腸菌ファージと宿主の相互作用の体系的な探索。 PLoSバイオル。 19、e3001424 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smyth, GK マイクロアレイ実験における差次的発現を評価するための線形モデルと経験的ベイズ法。 統計 Appl Genet Mol. 3、第 3 条 (2004)。

Google スカラー

アグストーニ、E. et al. クエンチングフリーのイオン交換クロマトグラフィーによるリアルタイムでの酵素進行曲線の取得。 アナル。 生化学。 639、114523 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カブシュ、W. XDS。 アクタクリスタログル。 D 66、125–132 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ポッタートン、L. et al. CCP4i2: CCP4 プログラム スイートへの新しいグラフィカル ユーザー インターフェイス。 アクタクリスタログル。 D 74、68–84 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

マッコイ、AJ 他フェイザー結晶解析ソフトウェア。 J.Appl. クリスタロガー。 40、658–674 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eswar、N.ら。 モデラーを使用したタンパク質構造の比較モデリング。 カー。 プロトック。 バイオインフォーム。 15、5.6.1–5.6.30 (2006)。

記事 Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: 分子グラフィックス用のモデル構築ツール。 アクタクリスタログル。 D 60、2126–2132 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

アフォニン、PV 他。 PHENIX におけるクライオ EM および結晶学のための実空間リファインメント。 アクタクリスタログル。 D 74、531–544 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

ペッターセン、EF 他。 UCSF ChimeraX: 研究者、教育者、開発者向けの構造視覚化。 タンパク質科学。 30、70–82 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilson, DS および Keefe, AD PCR によるランダム突然変異誘発。 カー。 プロトック。 モル。 バイオル。 51、8.3.1–8.3.9 (2000)。

Google スカラー

Newman, JR & Fuqua, C. L-アラビノース誘導性大腸菌 araBAD プロモーターおよび araC レギュレーターを運ぶ広範な宿主範囲の発現ベクター。 ジーン 227、197–203 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ハートマン、R.ら。 BiofilmQ による微生物群集の定量的画像解析。 ナット。 微生物。 6、151–156 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Budzik, JM、Rosche, WA、Rietch, A. & O'Toole, GA 緑膿菌 PAO1 および PA14 株の汎用形質導入ファージの単離と特性評価。 J.Bacteriol. 186、3270–3273 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

クローン作成にご協力いただいた F. Hamburger (バーゼル大学 Biozentrum) に感謝します。 ファージの単離と特性評価に対する支援については、E. Maffei と A. Harms (バーゼル大学バイオゼントルム) に感謝します。 この研究は、CM への Biozentrum PhD Fellowship、スイス国立科学財団 (UJ への助成金番号 310030_189253)、スイス国立科学財団によって資金提供された NCCR AntiResist (KD および UJ への助成金番号 51NF40_180541)、欧州研究評議会によって支援されました。 (KD への助成金番号 716734)、および Sygeforsikring Danmark、Danish Innovation Fund、Novoseed から MG および TT-N への助成金。

ティナ・イェーガー

現在の住所: バーゼル大学生物医学部門、バーゼル、スイス

ジェイコブ・G・マローン

現在の住所: 分子微生物学部門、ジョン・イネス・センター、ノリッジ、英国

Biozentrum、バーゼル大学、バーゼル、スイス

クリスティーナ・マナー、ラファエル・ディアス・テイシェイラ、ディビア・サハ、アンドレアス・カチュマルチク、ラファエラ・ゼンプ、ファビアン・ウィス、ティナ・イェーガー、ブノワ=ジョセフ・ラヴェンティ、ジェイコブ・G・マローン、セバスチャン・ヒラー、クヌート・ドレッシャー、ウルス・ジェナル

sciCORE、科学コンピューティングセンター、バーゼル大学、バーゼル、スイス

セバスチャン・ボワイエ

デンマーク工科大学化学科、リンビー、デンマーク

カトリーヌ・クヴォルトルップ

コスタートンバイオフィルムセンター、コペンハーゲン大学、コペンハーゲン、デンマーク

イェンス・ボー・アンデルセン、マイケル・ギブスコフ、ティム・トルカー=ニールセン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

概念化: CM、TJ、UJ 方法論: CM、RDT、DS、AK、RZ、TJ、B.-JL、JGM、JBA、MD、TT-N.、KQ、KD、UJ 形式分析: CM、RDT、SB調査:CM、RDT、DS、RZ、TJ、JGM、FW、JBA 執筆(原案):CM、UJ 資金調達:MG、TT-N.、KD、KQ、SH、UJ 監修:SH、KDそしてUJ

ウルス・ジェナルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた Tim Rick、Daniel Wozniak、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、hecR::Tn 変異体のコロニー形態。 b、WTおよびhec欠失株のコロニー形態。 実験は三重に行われました。 代表的な画像を1枚示します。 c、緑膿菌 WT および hec 欠失株の増殖。平均値と 3 つの生物学的反復 (それぞれ 6 つの技術的反復) の標準偏差。 d、IPTG誘導性プロモーター(EV、対照プラスミド)からのhec遺伝子の発現のためのプラスミドを含むWT株およびhec欠失株の増殖。 LB (破線) または 100 μM IPTG を添加した LB (実線) での増殖を記録し、3 つの生物学的反復 (それぞれ 3 つの技術的反復) の平均値と標準偏差を示します。 e、緑膿菌WT、およびIPTG誘導性プロモーターからhecEを発現するPelまたはPslエキソ多糖を欠く変異体のコロニー形態。 実験は三重に行われました。 代表的な画像を1枚示します。

a、BifAドメイン構造の概略図、およびHecEと特異的に相互作用することがY2Hによって同定されたBifAフラグメント(TM、膜貫通ドメイン;SID、最小相互作用ドメイン)。 b、AlphaFold によって予測された、細胞質膜 (灰色) に埋め込まれた BifA 二量体の三次元構造。 c、HecEのCoIP-MS分析。 免疫沈降実験は、PAO1 WT 株、または C 末端 FLAG タグ付き HecE および抗 M2 結合磁気ビーズを発現する株を使用して実行されました。 ビーズ上に保持されたタンパク質を質量分析法を使用して分析しました。 3 つの生物学的複製から得られたデータは、火山プロットとして示されています。 HecE-Flag と WT (ctrl) の間で検出されたペプチドの Log2 変換された強度比を計算し、有意性分析 (修正 t 統計、経験的ベイズ法 59) から得られた値に対してプロットしました。 d、空のプラスミド(EV)またはIPTG誘導性プロモーターからhecEを発現するプラスミドを含む緑膿菌野生型および変異株のコロニー形態。 実験は三重に行われました。 代表的な画像を1枚示します。 e、プラスミドコントロール(EV)またはc-di-GMPを発現するプラスミドを保有する緑膿菌野生型(WT)、hecR::TnおよびΔbifA株の増殖(上)および蛍光(c-di-GMPレベル、下)。 di-GMP センサー cdGreen。 2 つの生物学的反復 (それぞれ 6 つの技術的反復) の平均値と標準偏差が示されています。

a、hecR の発現により、HecR および HecE レベルが上昇します。 hecR または hecE の染色体 Flag タグ付きコピーを発現する株における HecR および HecE の免疫ブロット分析。 株には、アラビノース誘導性プロモーターからの hecR、hecE、または両方の遺伝子を発現するプラスミドが含まれていました (EV、コントロール プラスミド)。 誘導因子アラビノースの存在下 (+) または非存在下 (-) で増殖させた細胞の抽出物を、抗 Flag を用いた免疫ブロッティングによって分析しました (n = 1)。 b、HecR は hecRE プロモーター領域に結合します。 EMSA アッセイは、示されているように、hecRE プロモーター領域を含む標識 DNA と精製 HecR タンパク質の濃度を増加させて実行されました (n = 2)。 c、HecR は緑膿菌染色体上の hecRE 遺伝子座にのみ結合します。 クロマチンプルダウン実験は、染色体野生型 hecR コピーの非存在下で hecR の HA タグ付きコピーを発現する株と HA 特異的抗体を用いて行われました。 配列決定リードは、緑膿菌染色体全体 (上) または hecRE 遺伝子座 (下) について y 軸上にプロットされています。 グラフは、Biomatters によって作成された Geneious バージョン 2019.0 を使用して生成されました。 d、hecEを発現する細胞の割合は、緑膿菌の増殖中に変化します。 IPTG誘導性プロモーター(EV、コントロールプラスミド)からhecR、hecE、または両方の遺伝子を発現するプラスミドを含むhecRE-2mRレポーター株の増殖中に、光学濃度(実線)および蛍光(hecE発現、破線)を記録しました。 平均値と標準偏差は、それぞれ 3 つの技術的反復を含む 3 つの生物学的反復について示されています。 e、hecREを発現する細胞の画分は培地に依存しません。 hecRE-2mR 染色体レポーターを保有する緑膿菌野生型を、指定の培地で 20 時間培養しました。 フローサイトメトリーデータの定量化は、3 つの生物学的複製について示されています。 トリプリケートは独立してフィッティングされました。 計算値の平均値と範囲が表示されます。 平均の正規性はシャピロ・ウィルク検定を使用してチェックされました(P < 0.05)。 一元配置分散分析検定を使用して母平均の差を分析し (P < 0.05)、その後 Tukey の HSD 事後検定を使用して、調整された P 値を示しました。 f、hecREを発現する細胞の割合は、緑膿菌の増殖中に変化します。 IPTG誘導性プロモーターからhecRを発現するプラスミドを保有するhecRE-2mRレポーター株を新鮮なLBに希釈して戻し、12時間培養した(EV、対照プラスミド)。 フローサイトメトリーで測定したレポーターの蛍光強度はバイオリンプロット(左y軸)として示され、増殖は点描線(右y軸)で示されます。 示された閾値(灰色の線)よりも高いシグナル値を有する細胞を、hecRE-2mRを発現する細胞として計数した。 g. hecRE の発現は栄養制限に応答します。 緑膿菌 hecRE-2mR レポーター株を、唯一の炭素源として異なる量のコハク酸塩を含む MOPS 最少培地で培養しました。 hecREを発現する細胞の増殖および画分は図3fのように示されています。 h、i、示された量のコハク酸塩を含むMOPS中で37℃で培養した、ΔrsmA(h)およびΔrpoS(i)変異体におけるhecRE-2mRレポーターのフローサイトメトリーデータ。 PAO1野生型株よりも高い蛍光強度を有する細胞を定量した(右軸)。 フローサイトメトリー前の培養物の光学密度を点描線で示します(左軸)。 j、hecR の異所性発現は、定常期にのみ hecE 転写を誘導します。 野生型 (WT) および示された変異体における hecRE-2mR レポーターを有する株のフローサイトメトリー分析。 hecR を発現するプラスミドを含むレポーター株を、100 μM IPTG を補充した LB 中で対数期または 20 時間 (静止) 培養しました。 フローサイトメトリー実験は 3 つの生物学的複製について示されており、個々のヒストグラムがグラフに積み上げられています。 k、hecREを発現する細胞の割合は、温度が上昇すると増加します。 IPTG誘導性プロモーターからhecRを発現するプラスミドを保有する緑膿菌hecRE-2mRレポーター株を、示されているように温度を上昇させながら、100μM IPTGを補充したMOPS + 20 mMコハク酸塩中で培養しました(EV、対照プラスミド)。 フローサイトメトリー実験は 3 つの生物学的複製について示されており、個々のヒストグラムがグラフに積み上げられています。 l、aに示すイムノブロットのトリミングされていないスキャン。 m、フローサイトメトリー実験に使用されるゲーティング戦略。 hecRE-2mR レポーターを保有する野生型の 3 つの複製のうちの 1 つを示します。

a、d、緑膿菌野生型および変異株のバイオフィルム量の増加。 BiofilmQ70 を使用してバイオフィルムを一辺の長さ 2.34 μm の立方体に分割し、バイオフィルムの体積を任意の時点での個々の立方体すべての合計として計算しました。 赤い線は飛散現象の開始を示します。 1 つの実験の分析が各パネルに表示されます。 b、e、バイオフィルム境界までの距離(解像度、20ボクセル)、蛍光強度、局所細胞密度などのオブジェクトパラメーターは、BiofilmQを使用して計算されました。 c、f、分散イベントの開始時の蛍光強度(赤い線)がプロットされ、バイオフィルム境界までの距離に応じて色分けされています。

a、図5aに示す添付ファイルデータの平均の標準偏差。 b、IPTG誘導性プロモーターから大腸菌ジグアニル酸シクラーゼdgcZを発現するプラスミドとクミン酸誘導性プロモーターからさまざまなbifA対立遺伝子を発現するプラスミドを保有するWT株と変異株のマイクロタイタープレートベースの付着(EV、対照プラスミド)。 BifA 発現は誘導されませんでしたが、dgcZ 発現は 100 μM IPTG で誘導されました。 H6-335-P1 を指定の濃度で添加しました。 9.5時間後に付着を定量化した。 2 つの生物学的複製の平均値が示されています。 c、R状態(PDB: 4LYK)およびT状態(PDB: 4LJ3)におけるPdeL二量体のα6およびα5'の配置。 活性部位の残基および T 状態の立体構造の安定化に関与する残基が強調表示され、棒表示として表示されます。 d、R-(PDB: 8ARV)およびモデル化されたT状態におけるBifA二量体のα6およびα5'の配置。 活性部位の残基と、T 状態の立体構造を安定化すると仮定される保存残基が強調表示され、棒表示として示されています。 e、f、それぞれ図5d、eに示す添付ファイルデータの平均の標準偏差。

SCV画面

酵母ツーハイブリッドスクリーニング

SCVサプレッサースクリーン

構造データの収集と詳細化統計

hecE を発現する緑膿菌細胞は、バイオフィルム分散後も付着したままになります。

フローチャンバーで増殖させたバイオフィルムからの細胞の分散は、高度に調整されたプロセスです。

HecE を欠く変異体は、細胞分散後に成熟したバイオフィルムを維持できません。

BifA を欠く変異体では、早期のバイオフィルム形成と細胞分散が起こります。

WspR を欠く変異体は、細胞分散後に成熟したバイオフィルムを維持できません。

Springer Nature またはそのライセンサー (協会や他のパートナーなど) は、著者または他の権利所有者との出版契約に基づいて、この記事に対する独占的権利を保持します。 この記事の受理された原稿バージョンの著者によるセルフアーカイブには、かかる出版契約の条項および適用される法律のみが適用されます。

転載と許可

Manner, C.、Dias Teixeira, R.、Saha, D. 他遺伝子スイッチが緑膿菌の表面定着を制御します。 ナット マイクロバイオル (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01403-0

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 10 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 5 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01403-0

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供