排出ポンプ遺伝子増幅は、二重に対する耐性のための複数の標的変異の必要性を回避します

Nature Communications volume 14、記事番号: 3402 (2023) この記事を引用

10 オルトメトリック

メトリクスの詳細

複数の細胞標的を持つ抗生物質は理論的には耐性進化の頻度を減少させますが、そのような抗生物質に対する適応軌道と耐性メカニズムは十分に研究されていません。 今回我々は、DNAジャイレースとトポイソメラーゼIVの両方を標的とする新規フルオロキノロンであるデラフロキサシン（DLX）への曝露による実験的進化を用いて、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）におけるこれらを調査する。 我々は、コード配列変異の選択と、特徴が十分に解明されていない排出ポンプであるSdrMをコードする遺伝子のゲノム増幅が、高いDLX耐性をもたらし、両方の標的酵素における変異の要件を回避することを示す。 進化した集団では、sdrMと排出ポンプをコードする隣接する2つの遺伝子を含むゲノム増幅によるsdrMの過剰発現が高いDLX耐性をもたらす一方、隣接するヒッチハイク排出ポンプがストレプトマイシン交差耐性に寄与する。 さらに、sdrM が欠如すると、DLX 耐性を進化させるために両方の標的酵素に変異が必要となり、したがって sdrM により耐性進化の頻度が増加します。 最後に、2 つの異なる臨床分離株において sdrM の変異と増幅が同様に選択されており、この DLX 耐性メカニズムの一般性が示されています。 私たちの研究は、耐性率の低下の代わりに、多標的抗生物質に対する耐性の進化には、別の高頻度の進化経路が関与する可能性があり、それが抗生物質交差耐性を含む適応状況の予期せぬ変化を引き起こす可能性があることを強調しています。

抗菌薬耐性（AMR）の出現は、世界の健康に対する大きな脅威です。 最近の報告によると、2019 年には世界中で AMR が原因で 100 万人以上が死亡した可能性があります 1。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) は、高い発生率と死亡率で、医療関連および市中関連の広範囲の感染症を引き起こします。そして、ほとんどの入手可能な抗生物質に対する耐性を獲得することができます2、3、4、5、6、7。 細菌の耐性決定基は通常、水平遺伝子導入または新規突然変異のいずれかを介して獲得され、そのメカニズムには抗生物質の分解または隔離、標的成分の修飾、排出ポンプの過剰生産が含まれます8、9、10、11。 さらに、遍在的で不安定なゲノムの重複と増幅は、修飾酵素と排出ポンプの発現の増加につながり、抗生物質耐性を与え、抗生物質曝露時に選択される可能性があります12、13、14。

抗生物質耐性の上昇を抑えるために提案されている戦略の 1 つは、複数の標的をもつ抗生物質を開発し、それによって耐性進化の頻度を減らすことです 15,16。 最近の研究では、膜の完全性と追加の細胞経路を標的とする 2 種類の二重標的抗生物質が同定されており、これまでのところ実験室での耐性の出現は回避されています 17,18,19。 細菌のトポイソメラーゼ、DNA ジャイレース、およびトポイソメラーゼ IV も、二重標的抗生物質の潜在的な標的として提案されており、両方の酵素を標的とすることで耐性の進化が阻害され、新規の耐性決定因子が関与する可能性があることが示されています 15、16、20、21。 。 しかし、そのような多標的抗生物質に対する耐性進化のメカニズムとその根底にある適応軌跡は特徴付けられていません。

フルオロキノロンは広く使用されている種類の抗生物質であり、シプロフロキサシンやレボフロキサシンなどのほとんどの従来のフルオロキノロンは、DNA ジャイレースまたはトポイソメラーゼ IV22 のいずれかを優先的に標的とします。 デラフロキサシン (DLX) は第 4 世代のフルオロキノロン抗生物質で、同様の効力を持つ DNA ジャイレースとトポイソメラーゼ IV 酵素の両方を標的とします 23、24、25。 この二重標的のため、DLX に対する耐性はまれである可能性があると考えられていました 24,26,27 が、最近、黄色ブドウ球菌の臨床分離株で DLX 耐性が観察されました 28,29。

この研究では、DLX の濃度を増加させた場合の複数の独立した MRSA 集団の実験的進化を使用して、二重標的抗生物質に対する MRSA 耐性の進化を調査します。 DNA ジャイレースおよびトポイソメラーゼ IV 酵素の変異に加えて、主要な促進因子スーパーファミリーの排出ポンプ SdrM (ブドウ球菌薬剤耐性) のコード配列変異、および sdrM と隣接する排出ポンプ sepA および lmrS のゲノム増幅が、世界各地に広がっていることを我々は観察しました。進化した集団であり、通常は標準的な突然変異よりも早く進化します。 sdrM コード配列の変異は中程度の DLX 耐性を与え、そのような耐性の進化可能性を高めますが、ゲノム増幅は高い DLX 耐性をもたらします。 増幅領域のコピー数の変動は選択圧に依存し、DLX 耐性の集団不均一性の原因となります。 我々は、sdrM活性がDLX曝露時のこれらのゲノム増幅の選択に適応性の利点をもたらす一方で、ゲノム増幅における隣接する排出ポンプのヒッチハイクがアミノグリコシドストレプトマイシンに対する交差耐性を引き起こすことを発見した。 さらに、sdrM 活性が存在しない場合、DLX 耐性には DNA ジャイレース酵素とトポイソメラーゼ IV 酵素の両方の変異が必要であり、そのため発生頻度は低いことを示します。 最後に、DLX 耐性の選択時に、それぞれ 1 つの MRSA と 1 つのメチシリン感受性黄色ブドウ球菌 (MSSA) 臨床分離株の集団でも、sdrM ゲノムの増幅と変異が一般的であることを示します。

MRSA JE2 株の 10 個の独立した集団を、DLX の濃度を増加させながら、毎日 7 ～ 10 回継代して進化させました。 DLX は DNA ジャイレースとトポイソメラーゼ IV 酵素の両方を同様の効力で阻害するため、DLX に対する耐性がまれに発生する可能性があります 27。 ただし、10 個の集団すべてが、親 JE2 株の最小発育阻止濃度 (MIC) の 64 ～ 1024 倍の DLX 濃度で増殖できました (補足データセット 1、株の命名法については「材料と方法」を参照)。 JE2 株は、MH2 培地中で 0.133 ± 0.027 μg/ml の MIC を持ち、これは臨床上の限界点である 0.25 μg/ml を下回っています 23,24,25。 進化した各集団の最終継代からの3つの個別の分離株のDLX耐性についてテストしたところ、すべての分離株が〜2〜33μg / mlの範囲のDLX MICを示し（補足図1a）、高いDLX耐性の進化が確認されました。 我々は、これらの分離株と、進化の初期の段階からの追加の分離株および集団に対して全ゲノム配列決定を実行しました（補足データセット2）。 予想通り、いくつかの耐性分離株および集団では、DNA ジャイレース (gyrA または gyrB) またはトポイソメラーゼ IV (parC または parE) またはその両方のサブユニットをコードする遺伝子に変異がありました (図 1)。 gyrA の S85P および E88K、gyrB の R458L、parC の E84K および A116V、parE の D432G および P585S など、これらの標準的なターゲットで生じる一塩基多型 (SNP) のほとんどは、キノロン耐性決定領域 (QRDR) に位置しています。これらのタンパク質は、フルオロキノロン耐性と以前から関連付けられてきました26、30、31、32、33。 また、我々の変異体では、gyrB の W592R、parC の S520R、parE の S437P などの他の変異も同定されており、これらは新規の DLX 耐性対立遺伝子である可能性があります。

DNA ジャイレース サブユニット (gyrA、gyrB) および DNA トポイソメラーゼ IV サブユニット (parC、parE) をコードする遺伝子における変異の存在、3 つの変異対立遺伝子 sdrM1*、sdrM2*、および sdrM3*、および sdrM を含むゲノム増幅が示されています。 10 個の独立して進化した集団について、中間継代からの集団、および最終継代からの 3 つの分離株。 それぞれの独立した集団について、以前から後の継代が左から右に示されています。 青色または黄色の四角は、それぞれ集団または最終分離株における変異 (SNP または増幅) の存在を示します。 最終 DLX 濃度は、進化実験の最終濃度 (分離株が得られた時点) を表します。

多数の標準的な標的変異にもかかわらず、いくつかの耐性分離株および10の独立した集団のほとんどの中間継代からの集団は、DNAジャイレースまたはトポイソメラーゼIV酵素のいずれかをコードする遺伝子に標準的な変異を持たないか、またはいずれか1つのみに変異を持っていました。ターゲット (図 1 および補足データセット 2)。 これらには、集団 1、3、および 6 のすべてのサンプルと、集団 2、4、5、7、8、および 9 の複数の初期継代からの集団が含まれます。進化した gyrA* (gyrAE88K)、または parE* (parED432G)変異対立遺伝子は個別に、DLX MICの穏やかな増加を最大0.4μg / mlに引き起こし（補足図1b）、他の遺伝子が私たちの進化した集団のいくつかでDLX耐性に役割を果たしている可能性が高いことを示唆しています。

全ゲノム配列決定の結果をさらに検討したところ、排出ポンプ SdrM (ブドウ球菌薬剤耐性) の変異が進化した集団に共通していることが明らかになりました (図 1)。 SdrM は、メジャー ファシリテーター スーパーファミリー (MFS) からの排出ポンプです 34。 SdrM の過剰発現は、ノルフロキサシンおよび臭化エチジウムの MIC を 2 倍増加させることが示されていますが、この排出ポンプは抗生物質耐性の進化には関与していません 34。 プロモーター領域 (またはリプレッサー) で発生する典型的な排出ポンプ変異とは対照的に、進化した 10 集団のうち 8 集団に 2 つの sdrM コード配列変異、Y363H (sdrM1*) または A268S (sdrM2*) のいずれかが含まれていることを観察しました。しかし、進化した分離株のいずれも両方を持っていなかった（図1、補足データセット2）ため、これら2つの突然変異が同様の機能を持っている可能性が高まっています。 集団 6 は、A268S 変異 (sdrM3*) に加えて、sdrM コード配列の上流 (-164 位) に変異があり、これが sdrM 発現の制御に影響を与える可能性があります。

保存ドメインデータベース 35 を使用した他の既知の MFS 流出ポンプと SdrM アミノ酸配列のアライメントは、A268 および Y363 残基が SdrM 流出ポンプの結合ポケットに位置している可能性が高いことを示し (補足​​図 2)、変異が結合に影響を与えることを示唆しています。 SdrMからDLXへ。 AlphaFold36,37を使用したSdrMの予測タンパク質構造の視覚化は、A268とY363が互いに近接していることを示しました（補足図3）。

sdrM 対立遺伝子に加えて、全ゲノム配列決定結果のカバレッジ解析により、sdrM 遺伝子のカバレッジは、複数の進化した変異体ではゲノムの平均カバレッジよりも 2 ～ 5 倍高いことが明らかになりました。 WTは、10の進化した集団すべてにわたってsdrM遺伝子の増幅を示しています（図1、補足データセット2）。

我々は、野生型 (WT) JE2 株で個々の sdrM 対立遺伝子置換変異体を構築し、進化した対立遺伝子が DLX 耐性と排出に及ぼす影響を測定しました。 sdrM1* または sdrM2* 対立遺伝子を持つ構築された変異体は DLX 耐性の約 2 倍の増加を示しましたが、sdrM3* 対立遺伝子 (遺伝子間変異とコード配列変異の両方からなる) を持つ変異体は約 4 倍の増加を示しました (図2a)。 DLX38の固有蛍光を測定して、DLXの細胞内濃度を間接的に決定しました（補足図4a）。 3つの対立遺伝子置換変異体、ならびに対照としてWTおよびsdrMにトランスポゾン挿入を有する変異体（sdrM::Tn）の流出速度を計算しました（図2b）。 予想どおり、WT 株と sdrM::Tn 株の細胞内 DLX 濃度が最も高かったのに対し、3 つの対立遺伝子置換変異体はより低いレベルであり、進化した sdrM 対立遺伝子が流出の増加につながったことを示唆しています。 簡略化された数学モデルを使用して、sdrM1*、sdrM2*、および sdrM3* の DLX 流出速度は sdrM::Tn よりも約 2 ～ 9 倍高い一方、WT 速度は sdrM::Tn と同様であることが判明しました。 (補足図4b)。

WT の DLX MIC、および M63 の 3 つの sdrM 対立遺伝子置換変異体。 示されているデータは、5 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差です。 有意性は、WT との比較、または示されている変異体間の比較で示され、多重比較のための Tukey 検定を使用した一元配置 ANOVA によって検定されます (* P < 0.05、WT 対 sdrM1 の P = 0.0138、WT 対 sdrM2 = 0.0486、* *P < 0.01、sdrM1* 対 sdrM3* P = 0.0015、***P < 0.001、sdrM2* 対 sdrM3* P = 0.0004、****P < 0.0001)。 b 細胞内 DLX 濃度の代用として、示された株について正規化蛍光 (DLX/OD600 の固有蛍光) を測定しました。 示されているデータは、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準誤差です。 c それぞれのDLX MICの2.5倍で進化したときに、時間の経過とともにDLX耐性を進化させた、示された株の12の独立した集団の割合。 ソース データはソース データ ファイルで提供されます。

私たちの全ゲノム配列決定の結果から、10の進化した集団のうち8つで、sdrM変異（SNPまたは増幅のいずれか）が標準的なDNAジャイレースまたはトポイソメラーゼIV変異と比較してより早い継代で出現したことが観察されました（図1）。 これは、排出ポンプ変異が DLX 耐性の標準変異の選択を促進する進化のカスケードを示唆しています。 DLXの存在下でsdrM変異が耐性の進化に影響を与えるかどうかをテストするために、WTのそれぞれ12の独立した集団を進化させ、個々のsdrMを持つ変異体は、それぞれのMICの2.5倍である固定濃度のデラフロキサシンで毎日継代することで対立遺伝子を進化させました。 。 1つのWT集団のみが耐性を進化させましたが、実験中にsdrM1*、sdrM2*、およびsdrM3*のそれぞれ3〜4の集団が耐性を進化させました（図2c）。

私たちは、SdrM タンパク質の対立遺伝子の多様性を調べて、同定した進化した対立遺伝子 (A268S および Y363H)、または SdrM の結合ポケット内のその他の変異が、公的に入手可能な黄色ブドウ球菌分離株のゲノムに見られるかどうかを判断しました。 JE2 SdrM タンパク質配列は、NCBI 病原体検出データベースからの 63,980 個の黄色ブドウ球菌ゲノムのセットに対して照会されました。 Y363 位には変異は見られませんでしたが、A268S 変異を持つ 1 株と、A268V 変異を持つさらに 7 株を同定しました (補足データセット 3)。 さらに、これらの黄色ブドウ球菌株は、予測された SdrM 結合ポケットの他の残基に多数の変異を抱えていました。

sdrMの点変異に加えて、10の進化した集団にわたる全ゲノム配列データから、sdrM遺伝子を増幅する13の異なるタイプの増幅を特定しました（図1および3a、補足データセット4、補足図5）。 。 各増幅タイプの少なくとも 1 つの例が、PCR および新規接合部のサンガー配列決定によって確認されました。 すべての増幅の一端はsdrMの下流（末端1）に位置するrRNA-tRNA遺伝子クラスター内にあり、もう一方の末端はsdrM（末端2）の上流にある5つの遺伝子内または間にありました（図3a）。 これらの増幅のうち 5 つは 2 つの末端間に 4 ～ 12 塩基対の微小相同性がありましたが、他の増幅は単一塩基対の相同性があるか、または相同性がありませんでした (補足データセット 4)。 増幅のいくつかは複数の集団で見つかり、一部の集団では異なる継代で異なる増幅が見られ、増幅が動的であることを示しています（補足図6）。 sdrM遺伝子は、2つの追加の排出ポンプsepAおよびlmrS39、40の上流に存在し、これらの遺伝子は両方とも、すべての場合において増幅内に存在した（図3a）。 STRINGデータベース41を使用した遺伝子近傍分析により、3つの排出ポンプ（溶血素IIIファミリータンパク質とともに）が、ほぼすべてのブドウ球菌種のゲノム内で隣り合って見られることが示されました（補足図7）。

a 進化した集団で見られる sdrM ゲノム遺伝子座と 13 種類の排出ポンプ遺伝子増幅。 すべての場合における増幅の 2 つの末端を含む領域が示されています (末端 1 および 2)。 b 示された株のゲノム全体と比較した、増幅された領域の相対的なリード カバレッジ。 線は、最も近い 100 個の近傍を考慮した一般化された加算モデルを使用して平滑化された近似を表します。 c ゲノムDNAのqPCRによって測定された、WTと比較した、示された分離株におけるsdrM、lmrS、およびsepAのコピー数の変化倍数。 示されているデータは、3 回の技術的反復の平均 ± 標準偏差です。 d RT-qPCRで測定した、WTと比較した、示された分離株におけるsdrM、lmrS、およびsepAの発現の倍率変化。 示されているデータは、2 つの生物学的複製の平均です。 e M63 で示された分離株の DLX MIC。 示されているデータは、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差です。 f 細胞内 DLX 濃度の代用として、示された株の正規化された蛍光 (DLX/OD600 の固有蛍光)。 示されているデータは、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準誤差です。 有意性は、クラスカル・ワリス検定とそれに続く各比較の未補正ダン検定によって検定された c WT 値を 1 に設定し、ブラウン・フォーサイスおよびウェルチの一元配置分散分析検定とその後に続く対応のない分散分析検定によって検定された e WT との比較で示されます。各比較についてウェルチ補正を行った両側 t 検定 (*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001)。 c 1.7a: sdrM の P = 0.0025、lmrS = 0.0079、sepA = 0.0025、4.2a: sdrM の P = 0.0279、lmrS = 0.0438。 e、1.7a = 0.0295、4.2a = 0.0238、6c = 0.006のP。 b ～ f のソース データは、ソース データ ファイルで提供されます。

ゲノム増幅の影響をさらに特徴付けるために、非標準的変異 (1.7a、4.2a、および 6c) のみを含む 3 つの進化した分離株を分析しました。 3つの分離株はすべて排出ポンプ増幅を有すると予測され、1.7aは増幅タイプ9を有し、4.2aと6cの両方は増幅タイプ1を有しました（図3b、補足データセット4）。 4.2a には WT sdrM 対立遺伝子があり、1.7a には sdrM2* 対立遺伝子があり、6c には全ゲノム配列データの sdrM3* 対立遺伝子にマッピングされるリードが約 40% あり、増幅には WT 対立遺伝子と sdrM3* 対立遺伝子の両方が含まれていることを示唆しています。 さらに、1.7aおよび6cには他のいくつかの非標準遺伝子に変異がありましたが、これらの変異はDLXに対する耐性に影響を与えませんでした（補足データセット2、補足図8）。

sdrM、lmrS、および sepA 遺伝子は、1.7a、4.2a、および 6c でコピー数の 3 ～ 10 倍の増加を示しましたが、増幅を持たないと予測された対照の進化した分離株 3a では同様のコピーが示されました。ゲノムDNA qPCRおよび全ゲノムシーケンスからのカバレッジデータによって測定された、WTへの数（図3b、c、補足図9）。 さらに、定量的逆転写PCR（RT-qPCR）で測定したところ、1.7a、4.2a、および6cは、WT株と比較して3つの排出ポンプの遺伝子発現の5〜500倍の増加を示しました（図3d）。 特に 1.7a および 4.2a におけるコピー数と比較して劇的に高い発現は、増幅における排出ポンプの調節の変化を反映している可能性があります。 3つの分離株はすべて、親WT株と比較して〜5〜100倍高いDLX耐性と高いDLX流出を示しました（図3e、f）。

増幅された排出ポンプの過剰発現が個別に、または組み合わせて DLX 耐性を増加させることができるかどうかをテストするために、pKK30 プラスミド 42 を使用して、対応するネイティブ プロモーターの制御下で sepA、lmrS、または親または進化した sdrM 対立遺伝子を過剰発現しました。 これらの株では、流出ポンプの発現は、空のベクター対照と比較して約10〜100倍増加しました（補足図10a）。 WT sdrM対立遺伝子の過剰発現により、DLX流出活性と耐性が約2倍増加しましたが、sdrM1*、sdrM2*、およびsdrM3*対立遺伝子は約4〜6倍の増加を示しました（補足図10b、c）。 。 さらに、sepAおよびlmrSの過剰発現はDLX耐性の有意な増加にはつながらず、3つの排出ポンプすべての過剰発現はWT sdrM対立遺伝子の過剰発現と同様の耐性をもたらし、sdrM過剰発現がおそらく次のような原因によって引き起こされるDLX耐性の主な原因であることを示しています。ゲノム増幅（補足図10b）。

一般に、増幅の不安定性はコピー数の変化、ひいては発現の変化を引き起こしますが、これは環境条件の選択の強さに依存する可能性があります 12,14。 増幅の安定性をテストするために、2 つの濃度の DLX および抗生物質を含まない培地で 1.7a および 6c を 2 日間継代し、全ゲノム シーケンスを使用して各継代の sdrM リード カバレッジを決定しました。 sdrMのコピー数は、DLXでの継代時に増加し、抗生物質なしで継代すると減少しました。これは、ゲノム増幅におけるsdrMのコピー数、およびおそらくその発現がDLX曝露のレベルに依存していることを示しています（図4a、b）。 。 さらに、6cにおけるsdrM3*対立遺伝子の2つの変異（A268Sコード配列変異および上流変異）の頻度は、DLX継代で増加し、抗生物質を含まない培地での継代で減少しました（図4a）。 高濃度の DLX で 2 日間継代され、より高い増幅コピー数を示した分離株では、6c については DLX 耐性が約 2 倍増加し、1.7a については穏やかな増加が示されました (図 4c、d) ）。

sdrMのコピー数、およびDLX培地なし、または2つの濃度のDLXで継代したときの6cのsdrM3*対立遺伝子を構成する2つの突然変異の対立遺伝子頻度。 b DLX 培地なし、または 2 つの濃度の DLX で継代したときの 1.7a の sdrM のコピー数。 2 つの独立した継代実験からのデータが両方について示されています。 c、d DLXなし、4 μg/ml DLX (DLX 4)、または6cおよびd 8 μg/mlのc 6 μg/ml DLX (DLX 6)のいずれかでの2回目の継代後の6cおよび1.7a集団のM63におけるDLX MIC DLX (DLX 8) 1.7a 用。 示されているデータは、2 つの独立した継代実験からそれぞれ得られた 2 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差です。 e MH2で示された抗生物質について、2μg/ml DLX（1.7a_DLX）中で一晩増殖させたWT、1.7a、または1.7aのMIC。 示されているデータは、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差です。 f MH2におけるpKK30過剰発現株のストレプトマイシンMIC。 示されているデータは、4 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差です。 有意性は、多重比較のためのホルム・シダック検定を用いた一元配置分散分析によってテストされた、それぞれの DLX なしコントロール、e WT、および f 空ベクターを持つ株との比較で示されます (* P < 0.05、* *P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001)。 a 「相対的な sdrM 適用範囲」の場合、DLX 4 μg/ml: 継代 1 の P = 0.0012、継代 2 = 0.0067、DLX 6 μg/ml: 継代 1 の P = 0.001、継代 2 = 0.0018。 「A268S の対立遺伝子頻度」 DLX 4 μg/ml: 継代 1 の P = 0.0052、継代 2 = 0.0164、DLX 6 μg/ml: 継代 1 の P = 0.0052、継代 2 = 0.0097; 「遺伝子間変異の対立遺伝子頻度」については、DLX 4 μg/ml: 継代 1 の P = 0.0018、DLX 6 μg/ml: 継代 1 の P = 0.0018。 b、DLX 4 μg/ml: 継代 1 の P = 0.0312、継代 2 = 0.0020、および DLX 8 μg/ml: 継代 1 の P = 0.0092。 DLX 8 μg/ml の d P = 0.048; e、アクリフラビン：1.7aのP = 0.0025、1.7a_DLX = 0.0002。 クロラムフェニコール: 1.7a_DLX の P = 0.0035; sdrM+lmrS+sepA の f P = 0.0001。 ソース データはソース データ ファイルで提供されます。

増幅における 3 つの排出ポンプの存在と、その結果として生じる高発現を考慮して、DLX の存在下および非存在下で増殖させた 1.7a の耐性を、さまざまな抗生物質のパネルに対してテストしました。 ほとんどの抗生物質に対して耐性の増加は見られませんでしたが、DLXで増殖させた1.7aはアミノグリコシドストレプトマイシンに対して交差耐性を示しました（図4e）。 さらに、sdrM単独ではなく、3つの排出ポンプすべての過剰発現により、ストレプトマイシン耐性が同様に増加しました（図4f）。これは、ストレプトマイシン耐性にはlmrSおよびsepAの発現増加も必要であることを示しています。

sdrM::Tn 株には、WT と比較して追加の変異がなく、M63 で WT と同様の増殖を示し（補足図 11a、b）、MIC が WT よりも約 2 倍低かった（図 5a）。 SdrM が WT MRSA 株の固有の DLX 耐性レベルに寄与していること。 ゲノム増幅の選択における sdrM の役割を理解するために、我々は、最初の進化と同様に、DLX の濃度を増加させながら、トランスポゾン変異株 sdrM::Tn と WT (対照として) のそれぞれ 3 つの独立した集団を進化させました。 3つのsdrM::Tn進化した集団すべてにおいて、トランスポゾンの挿入が進化中に安定であることを確認しました（補足図11c）。 進化中に、集団はそれぞれのMICの約640〜1000倍のDLX濃度で成長し、WTとsdrM::Tnの両方の最終進化集団は高いDLX MICを示しました（補足図11d）。 3 つの独立して進化した WT 集団のうち 2 つで、sdrM 遺伝子座のゲノム増幅が見られました。 3 番目の集団も増幅に関連するジャンクションを示しましたが、コピー数の増加は増幅の存在を示す 1.3 倍の閾値よりも低かったです。 各 WT 集団には、元の進化では見られない新しい増幅タイプがありました (補足データセット 4)。 ただし、sdrM::Tn 集団にはこれらの増幅はありませんでした (図 5b)。 さらに、WT 集団とは異なり、sdrM::Tn 進化の中間および最終継代で配列決定されたすべての集団には、DNA ジャイレース酵素とトポイソメラーゼ IV 酵素の両方に変異があり、高い DLX 耐性は、対照的に二重標的変異によるものであることが示唆されました。増幅に至る（図５ｂ）。

M63 の WT 株および sdrM::Tn 株の DLX MIC。 示されているデータは、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差です。 有意性は、対応のない両側 t 検定によって検定された WT との比較で示されます (*P = 0.0112)。 b DNA ジャイレース サブユニット (gyrA、gyrB) および DNA トポイソメラーゼ IV サブユニット (parC、parE) をコードする遺伝子における変異の存在、3 つの変異対立遺伝子 sdrM1*、sdrM2*、および sdrM3*、および sdrM を含むゲノム増幅が示されています。 WT 株と sdrM::Tn 株のそれぞれ 3 つの独立して進化した集団の中間継代からの集団について。 c 各プレート上で cfu/ml として測定された、DLX なしの対照と比較した、複数の DLX 濃度における示された分離株の生存率。 示されているデータは、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差です。 d それぞれのDLX MICの2.5倍（WTの場合は0.55μg/ml、sdrM::Tnの場合は0.32μg/ml）で時間の経過とともにDLX耐性を進化させた、示された株の12の独立した集団の割合。 (a、c、d) のソース データは、ソース データ ファイルで提供されます。

増幅は不安定であり、一般に集団における抗生物質ヘテロ耐性の基礎となることが知られていますが、DNA 配列の変化による耐性はより安定で均一であると予測されます。 したがって、我々は、ゲノム増幅はあるが標準的な標的変異を持たない進化した分離株 1.7a および 6c と、 gyrA、gyrB、および parE (図 5b、補足データセット 2)。 我々は、抗生物質を含まない培地で分離株を一晩増殖させ、その後、異なる DLX 濃度で増殖できる集団の割合を決定しました。 sdrM::Tn進化分離株（Tn_3b）は、テストしたすべての濃度で約100％のDLX耐性を示しましたが、1.7aおよび6cは集団の不均一性を示し、約10％以下の細胞のみがDLX耐性を示したことが観察されました（図5c）。 。

進化したすべてのsdrM::Tn集団における両方の標的酵素の変異の存在（図5b）は、sdrMの非存在下では、両方の標的の変異が高いDLX耐性に不可欠であることを示唆しました。 したがって、我々は、進化したsdrM対立遺伝子をテストする実験と同様に、sdrMの存在がDLX耐性の進化に影響を与えるかどうかをテストしました（図2c）。 各株のそれぞれの MIC (WT では 0.55 μg/ml、sdrM::Tn では 0.32 μg/ml) の 2.5 倍の固定濃度の DLX で、WT と sdrM::Tn のそれぞれ 12 の独立した集団を進化させました。耐性の進化を助けるために、5日目にさらに1日成長します。 12のWT集団のうち5つが6日間でDLX耐性を進化させましたが、12のsdrM::Tn集団のうち1つだけが8日で耐性を進化させました。これは、sdrMの存在がDLX耐性の進化可能性を高めることを示しています（図5d）。

我々は、2 つの黄色ブドウ球菌臨床分離株について、DLX 耐性の進展に伴う sdrM 変異の発生率と増幅を検査しました。 2 つの黄色ブドウ球菌臨床分離株は、もともと 2 人の嚢胞性線維症患者から分離されました。 CF001 はクローン複合体 8 (CC8) 配列タイプ 8 (ST8) の MRSA 株であり、CF106 は CC1 ST188 MSSA 株です (補足データセット 5)。 CF001のDLX MICはWT株JE2より約2倍低いのに対し、CF106のDLX MICはJE2より約50倍低かった（図6a）。 DLX濃度を増加させながらCF001とCF106の両方のそれぞれ3つの独立した集団を進化させ、中間継代から集団を配列決定しました（図6b）。 CF001 と CF106 の両方の 3 つの集団のうち 2 つは sdrM2* 対立遺伝子を持っていましたが、CF001 と CF106 の進化した集団はすべて sdrM ゲノム増幅を持っていました。

a JE2 (WT) および 2 つの臨床分離株 CF001 および CF106 の DLX MIC。 示されているデータは、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差です。 有意性は、多重比較のためのホルム・シダック検定を用いた一元配置分散分析によって検定された WT との比較で示されます (**P = 0.0024、****P < 0.0001)。 b DNA ジャイレース サブユニット (gyrA、gyrB) および DNA トポイソメラーゼ IV サブユニット (parC、parE) をコードする遺伝子における変異の存在、3 つの変異対立遺伝子 sdrM1*、sdrM2*、および sdrM3*、および sdrM を含むゲノム増幅が示されています。臨床分離株 CF001 および CF106 の 3 つの独立して進化した集団の中間継代からの集団について。 a のソース データは、ソース データ ファイルで提供されます。

複数の細胞標的を持つ抗生物質に対する耐性には細胞内の複数の変異が必要である可能性が高く、そのため頻度は低いと予測されます。 しかし、そのような抗生物質に対する耐性に至る進化の経路は十分に特徴付けられていません。 この研究では、二重標的化第4世代フルオロキノロンDLXへの曝露によるMRSAの進化が、十分に特徴付けられていない主要促進因子スーパーファミリー排出ポンプをコードする遺伝子であるsdrMのコード配列と上流変異の両方を介して耐性を引き起こすことを示した。 sdrMの遺伝子増幅。 さらに、sdrM 遺伝子座に隣接する 2 つの追加の排出ポンプの存在、したがってゲノム増幅におけるそれらのヒッチハイクにより、アミノグリコシド ストレプトマイシンに対する交差耐性が生じました。 sdrM が存在しない場合、株は DLX 耐性を獲得するために標準的な標的である DNA ジャイレースとトポイソメラーゼ IV の両方に変異を必要とするため、DLX 耐性の進化可能性が低下しました。 したがって、sdrM の変異と増幅は、高い DLX 耐性へのよりアクセスしやすい適応経路を提供しました。 私たちの結果は、複数の標的を持つ抗生物質が誤って別の適応軌道を導き、耐性の急速な進化を可能にするだけでなく、細菌の適応状況にさらなる好ましくない変化をもたらす可能性があることを示唆しています。

排出ポンプは、抗生物質にさらされたときに細胞を迅速に保護すると考えられており、排出ポンプの変異は一般に抗生物質耐性と関連しています 45。 MRSA には、複数のタンパク質ファミリーからのいくつかの排出ポンプが存在します。 MFS ファミリーのポンプには、染色体にコードされた NorA、NorB、NorC、LmrS、MdeA、および SdrM が含まれており、これらのポンプのプラスミドベースの過剰発現により、フルオロキノロン、第 4 級アンモニウム化合物、および色素に対する耐性が付与される可能性があります 46,47。 NorA の変異は、特にフルオロキノロンに対する抗生物質耐性の進化と関連していますが 48、sdrM 変異はこれまで関与していませんでした。 したがって、我々の研究は、特に新しく開発された抗菌薬に対して、あまり特徴が解明されていない排出ポンプが AMR の発症に役割を果たしている可能性があることを示しています。 さらに、大腸菌またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌株におけるプラスミドベースのlmrSおよびsepAの過剰発現は、リネゾリド、エリスロマイシン、およびカナマイシンを含む複数の抗生物質に対する耐性の増加につながる可能性があることが以前に示唆されていた39、40、49。 しかし、これらの排出ポンプを過剰発現する進化した分離株では、これらの抗生物質に対する交差耐性は観察されず、この耐性が大腸菌または黄色ブドウ球菌株に特異的である可能性があることが示されました。

抗生物質耐性に関連する排出ポンプ変異は通常、排出ポンプの発現を増加させ、それによって細胞内の抗生物質濃度を低下させます。 このような変異は、ほとんどの場合、ポンプのプロモーター領域またはリプレッサーのいずれかに位置しますが、排出ポンプのゲノム増幅も観察されています 50,51。 私たちの進化では、sdrMの発現を増加させる転写抑制因子変異は同定されず、sdrMの上流に変異があったのは1つの集団のみでしたが、sdrMの増幅は独立して進化した10の集団すべてで共通でした。 これは、高い DLX 耐性に必要な sdrM 発現の実質的な増加は、プロモーターまたはリプレッサーの変異ではほとんど達成できないことを示唆しています。 増幅を伴う進化した分離株では、sdrMおよび隣接する排出ポンプlmrSおよびsepAの発現レベルは、コード遺伝子のコピー数と比較してはるかに高く（図3c、d）、これらの遺伝子の制御が細胞内で変化していることを示唆しています。増幅。 興味深いことに、通常非常に高度に発現される tRNA-rRNA 遺伝子のクラスターは、sdrM、lmrS、および sepA の下流に位置していますが、排出ポンプをコードする遺伝子の増幅されたコピーの上流に位置しています。 これは、肺炎連鎖球菌で以前に観察されたのと同様に、tRNA-rRNA 遺伝子からのリードスルー転写が、増幅を含む進化した分離株で観察された排出ポンプ発現の高度な増加をもたらす可能性がある可能性を高めます51。

排出ポンプのコード配列変異は、緑膿菌（mexB、mexY）、肺炎桿菌（kmrA）、淋菌（mtrD）の抗生物質耐性を高めることも示されており、これはおそらく抗生物質に対する親和性の増加によるものと考えられます52、53、54。 最近の研究では、排出ポンプの発現増加は、突然変異率の増加55,56、プラスミド取得時の耐性決定基の発現の可能性57、または両方の菌株の抗生物質曝露時の適合性の増加により耐性突然変異の選択を促進することにより、抗生物質耐性を促進する可能性があることを示唆しています。耐性突然変異と排出ポンプの過剰発現58。 また、SdrM 結合ポケット内のコード配列の変異により、DLX への結合が変化することにより、DLX 耐性と流出が増加することもわかりました。 sdrM3 * 上流変異はおそらく sdrM 流出ポンプのレベルの上昇をもたらし、それが次に DLX 流出と抵抗の大幅な増加につながりました（図 2a、b）。 さらに、sdrM 変異対立遺伝子の DLX 耐性の適度な増加は、WT と比較して DLX 耐性の進化の増加を促進しました。このことは、コーディング配列の排出ポンプ変異も、より高いレベルの耐性をもたらす追加の変異の進化を促進できる可能性があることを示唆しています。これはおそらく、組み合わせ変異体の耐性の相乗的な増加、または適応度の上昇によるものと考えられます。 最後に、我々は、sdrM の増幅が DLX 耐性への単一段階の適応経路を提供する一方で、DNA ジャイレースおよびトポイソメラーゼ IV 酵素における少なくとも 2 つの変異が、sdrM の非存在下およびしたがって、機能的なsdrM遺伝子はDLX耐性の進化可能性を高めた。 達成されたDLX耐性の最終的なレベルはWT株とsdrM::Tn株の間で同様でしたが（補足図11d）、WTにおけるsdrMの存在により、DLX耐性のより迅速かつ頻繁な進化が可能になりました（図5d）。 ゲノム増幅は、ゲノム配列の変異よりもはるかに一般的であると考えられているため、sdrM コード配列変異と増幅の組み合わせも、2 つの標的酵素におけるコード配列変異の組み合わせよりも頻繁に発生した可能性があります。

我々の進化した集団における DLX 耐性には複数の変異が寄与しており、その中で最も重要な決定要因はおそらく sdrM 進化対立遺伝子、sdrM 増幅、および DNA ジャイレースとトポイソメラーゼのサブユニットにおける標準変異です。 これらのカテゴリー内では、存在する特定の sdrM、gyrA、gyrB、parC、および parE 対立遺伝子、および sdrM 増幅コピー数が、見られる耐性の正確なレベルに影響を与える可能性があります。 ジャイレース酵素またはトポイソメラーゼ酵素のいずれかにおける単一の変異、および進化したsdrM対立遺伝子の単一コピーは、DLX MICの2〜4倍の増加につながります（補足図1b、図2a）。一方、両方のDNAにおける変異は、DLX MICの2〜4倍の増加につながります。進化したsdrM::Tn集団で見られるように、ジャイレースおよびトポイソメラーゼIV酵素は、WTの40〜250倍高い高いDLX MICを引き起こす可能性があります（図5b）。 sdrMの増幅も同様に高いDLX耐性をもたらし、その結果、WTよりも5〜100倍高いDLX MICが得られます（図3e）。 sdrM過剰発現株では3〜9倍高いDLX耐性が観察されました（補足図10b）。これは、進化した分離株1.7a、4.2a、および6cの耐性よりも低かった（図3e）。 これは、これらの進化した分離株の一部で見られた著しく高いsdrM発現（図3d、補足図10a）、ならびにDLX曝露によるsdrM増幅のコピー数の増加とその後のsdrM発現の増加によるものと考えられます。 DLX MIC (図 4)。 プラスミドベースの sdrM 過剰発現は、ゲノム増幅の動的な性質を再現する可能性が低く、そのため、進化した分離株と構築された対立遺伝子置換および過剰発現変異体の間の耐性レベルを直接比較することができません。

臨床で分離された黄色ブドウ球菌株には大きな多様性があります 59 が、我々の実験では、DLX 曝露時には、異なるクローン複合体からの臨床分離株であっても、sdrM ゲノム増幅および少なくとも sdrM2* 対立遺伝子の選択が一般的であることが示されています。 DLX は最近 (2017 年) に FDA によって臨床使用が承認されたばかりです 26。そのため、臨床における DLX 耐性の選択、およびその後の耐性分離株の配列決定はまだ一般的ではありません。 以前の研究で同定され、配列決定された少数の DLX 耐性黄色ブドウ球菌臨床分離株には、DNA ジャイレース酵素とトポイソメラーゼ IV 酵素の両方に変異がありました 28。 しかし、これらの分離株は DLX の承認と臨床使用前に収集されたものであるため、標的変異の獲得につながった選択圧や変異経路は不明です。 DLX耐性黄色ブドウ球菌臨床分離株を調べた別の最近の研究でも、DNAジャイレースおよびトポイソメラーゼIVサブユニットの変異が同定され、少なくとも1つの分離株におけるDLX耐性における排出ポンプの役割が示された29。 63,000を超える黄色ブドウ球菌のゲノムを分析した結果、A268SおよびY363Hの変異はまれであるものの、結合ポケット内にあると予測される残基を含むSdrMの他の変異が豊富であることも示されました。 これらの変異は、DLX およびその他の抗生物質に対する黄色ブドウ球菌耐性、および耐性の進化に潜在的に影響を与える可能性があります。

ゲノムの重複と増幅は、培養中の細菌細胞の 10% に存在すると推定されており、その頻度が高いため、抗生物質耐性を含むストレスへの早期適応に重要な役割を果たしていると考えられています 12,14。 私たちの研究は、排出ポンプのゲノム増幅が抗生物質耐性を引き起こす可能性があり、特に高レベルの耐性を得るために複数のそのような変異が必要な場合、より安定した耐性変異の迅速な進化を可能にする進化経路の最初のステップである可能性があることを示しています。

ゲノム増幅は通常不安定で、選択圧がないと失われることが多く、集団の不均一性や抗生物質のヘテロ耐性につながります 43,44。 私たちの研究でも同様の増幅不安定性が観察され、DLX 耐性の集団の不均一性が引き起こされました。 さらに、高濃度の DLX で処理すると増幅コピー数が増加し、その結果 DLX 耐性が増加し、ストレプトマイシンに対する交差耐性も増加しました。 以前の研究では、フルオロキノロンに対するヘテロ耐性は4つの病原体からの臨床分離株ではほとんど見られず、これは標的変異を必要とする耐性に起因すると考えられていました44。 しかし、私たちの研究は、MRSAでは排出ポンプのゲノム増幅が高いフルオロキノロン耐性を引き起こす可能性があることを示しています。 ゲノム増幅の不安定性は、実験室研究や臨床研究におけるゲノム増幅の検出不足につながる可能性が高く、そのため抗生物質耐性におけるゲノム増幅の役割はおそらく過小評価されています。

ゲノム DNA に対する qPCR と全ゲノム シーケンス サンプルのカバレッジ深度の両方を使用して、増幅のコピー数を定量しました。 ただし、単一株の同質遺伝子集団内であっても増幅が不安定であり、その結果生じる不均一性を考慮すると、集団内の増幅のコピー数分布をより正確に測定するには、カバレッジ深度の高いロングリードシーケンシングが必要になる場合があります。

興味深いことに、16 の異なるゲノム増幅タイプの sdrM が 13 の独立した WT 集団で観察され、増幅は各集団内で動的であり、その不安定性がさらに強調されました。 さらに、複数の独立した集団において同じ増幅が生じ、選択されることを観察したことから、DNA切断と増幅が特定のゲノム部位で優先的に起こる可能性があることが示唆されました。 増幅ジャンクションの配列は、最大 13 bp の微小相同性、または相同性がなく、RecA 媒介組換えに必要な 20 ～ 40 bp の閾値未満で構成されていました 14。 これは、私たちの進化した集団における最初の重複が、現在まで黄色ブドウ球菌では報告されていない非相同末端結合、または代替末端結合を介して起こった可能性が高いことを示唆しています60。

DNA 切断は、細菌と真核生物系の両方でゲノム増幅の形成に寄与します 14,61。 DNA ジャイレースおよびトポイソメラーゼ IV 酵素は、DNA 内のトポロジカル ストレスを軽減し、寿命の短い DNA 二本鎖切断を生成し、その後再連結されます。 フルオロキノロンは通常、DNA と複合体を形成して DNA ジャイレースまたはトポイソメラーゼ IV に結合し、DNA 切断を促進するとともに DNA 末端の再連結を強力に阻害する可能性があり、その結果 DNA 二本鎖切断が増加します 62,63。 したがって、フルオロキノロン系抗生物質はゲノム増幅の形成を促進する可能性があり、我々の研究では、DLX 曝露時に sdrM を含むゲノム増幅の広範な生成と選択が観察されました。 また、最近の研究では、DNA 再連結を阻害する DNA ジャイレース毒アルビシジンへの曝露により、ネズミチフス菌および大腸菌における阻害タンパク質のゲノム増幅が引き起こされ、アルビシジン耐性がもたらされることが示されており、さらに、DNA トポイソメラーゼ酵素の阻害が、DNA 再連結を阻害する可能性があることを示しています。ゲノム増幅の形成65．

多標的抗生物質または薬剤の組み合わせは、抗生物質耐性の頻度を減らすと考えられています。 しかし、私たちの研究は、そのような治療の標的の1つがDNAジャイレースまたはトポイソメラーゼ酵素である場合、代わりにDNAの切断によって生じる遺伝子増幅を選択し、耐性の急速な進化を引き起こす可能性があり、これらの増幅はまた、交差抵抗を含む、追加の予期せぬフィットネス結果につながります。 したがって、新しい抗菌療法の情報を得るには、ゲノム増幅に影響を与える遺伝的および環境的要因、ならびにそのような増幅の選択によりアクセス可能な適応軌道を、特に臨床現場でより深く理解することが必要である。

この研究で使用したすべての株とプラスミドは補足表 1 に記載されています。臨床分離株はシアトル小児病院の嚢胞性線維症財団分離コアから入手したもので、もともと 2 人の異なる嚢胞性線維症患者から分離されました。 これらの分離株の配布は、シアトル児童承認 IRB プロトコール #14977 の対象となっています。

液体培地でのすべての実験は、改変 M63 培地 (13.6 g/L KH2PO4、2 g/L (NH4)2SO4、0.4 μM クエン酸第二鉄、1 mM MgSO4、pH を7.0 with KOH) 0.3% グルコース、0.1 μg/ml ビオチン、2 μg/ml ニコチン酸、1× Supplement EZ (Teknova) および 1× ACGU 溶液 (Teknova)、または Mueller Hinton Broth 2 (MH2) (Millipore) を添加sigma) 1× ACGU の有無にかかわらず。 クローニングおよび株構築のために、株をLB液体培地（10 g/L バクトトリプトン、5 g/L 酵母エキス、10 g/L NaCl）またはLBプレート（15 g/L 寒天を含む）上で増殖させ、適切な抗生物質 (10 μg/ml クロラムフェニコール、50 μg/ml アンピシリン、10 μg/ml トリメトプリム) または対抗選択用の 0.4% パラクロロフェニルアラニン (PCPA)。 MH2プレートはMH2寒天(Millipore sigma)で作製し、1×ACGUおよびDLX(0.5、1、または2μg/mlのいずれか)を適切に補充した。

黄色ブドウ球菌 JE2 細胞の 10 個の独立した集団を、修飾 M63 培地中、37 °C で 300 rpm で振盪しながら、漸増濃度の DLX の存在下で、毎日 50 ～ 100 倍に希釈して、 DLXを含む2mlの新鮮な培地。 進化は 0.05 ～ 0.25 μg/ml DLX の間で始まり、濃度は曝露ごとに 1.5 ～ 2 倍に増加しました。 株が開始濃度で増殖しなかった場合は、より低い DLX 濃度を選択して進化を開始しました。 進化の過程で、個体群が 1 日経過しても目に見える成長を示さなかった場合は、追加の 1 日の成長が許可されました。 2 日経っても成長が見られない場合は、進化を前の継代にリセットし、次の継代ではより小さい DLX 増分が選択されました。 2回の試行で集団がその後の濃度で増殖しなかった場合、128μg/ml、または8μg/ml後の任意の継代で進化を停止した。 母集団の詳細は補足データセット 1 にあります。

同様の設定を使用して sdrM::Tn 変異体を進化させました。sdrM::Tn と WT のそれぞれ 3 つの独立した集団が並行して進化し、DLX 濃度 0.1 μg/ml から開始し、濃度を 1.5 ～ 2 μg/ml 増加させました。 -露出ごとに折ります。 同様に、臨床分離株の進化のために、CF001 については 0.1 μg/ml、CF106 については 0.002 μg/ml の DLX 濃度から開始して、CF001 および CF106 の 3 つの独立した集団を並行して進化させました。 濃度は曝露ごとに 1.5 ～ 2 倍に増加しました。 進化は上記のように停止されました。

初期進化から独立して進化した 10 個の集団のそれぞれに、P1 ～ P10 のラベルが付けられました。 したがって、P1 は最初に独立して進化した集団を意味します。 継代番号を表すドットと 2 番目の数字を導入します。たとえば、P1.7 は、最初に進化した集団の 7 回目の継代を示します。 各数字の末尾にある文字は、それが分離株であることを示します。たとえば、1.7a は集団 P1.7 から抽出された分離株を示します。 最終継代からの分離株は集団番号と文字で表されます。たとえば、1a は集団 P1 の最終継代からの分離株です。

ゲノム DNA は、Qiagen DNeasy Blood and Tissue キットを使用して、選択された集団および分離株から調製されました。 次に、Illumina Nextera XT DNA Library Preparation キットを使用して、インデックス付きシングルエンドまたはペアエンド ライブラリーを調製し、Illumina MiSeq または Nextseq 500 シーケンサーで配列決定しました。 データは前述のとおりに分析されました 66,67。そこでは、cutadapt v4.068 を使用して Illumina アダプターが削除され、trimmomatic v0.3969 でリードがトリミングされ、または fastp v0.23.267 を使用して両方のステップが実行され、進化した集団および進化した集団における突然変異が分析されました。分離株はbreseq v0.37.170を使用して特定されました。 親株と比較して、標準的な標的または排出ポンプをコードする遺伝子の進化した集団で特定された変異、およびそれぞれ独立して進化した集団の最終継代からの集団に存在するすべての変異は、補足データセット 2 にリストされています。少なくとも 30% の頻度で集団が存在するとみなされました。

臨床分離株 CF001 および CF106 のゲノムは、PATRIC72 (現在は細菌およびウイルス バイオインフォマティクス リソース センターに統合されています) 上の Unicycler v0.4.871 を使用して構築されました。 組み立てられたコンティグには、Prokka v1.14.673 を使用してアノテーションが付けられました。 これらの注釈付きゲノムは、breseq を使用してそれぞれの進化した集団における変異を特定するための参照として使用されました。

CF001 および CF106 の MLST はオンラインの PubMLST データベース (pubmlst.org)74 を使用して実行され、SCCmec タイピングは Staphoopia-sccmec75 を使用して実行されました。

全ゲノム配列決定データにおける各塩基対のカバレッジの深さは、breseq v0.37.1 の BAM2COV コマンドを使用して決定されました。 全ゲノムまたは対象の各遺伝子について、すべての塩基対のカバー率を合計し、配列の長さ (塩基対の数) で割りました。 次に、遺伝子の塩基対あたりの対応するリード数をゲノム全体のリード数で割ることによって、カバレッジの変化倍数を決定しました。 sdrM 増幅を特定するには、サンプルが sdrM 増幅を引き起こすゲノム結合 (breseq によって決定) を持ち、sdrM の相対リード カバレッジの閾値を満たす必要がありました。 分離株の場合、sdrM の相対的な適用範囲は（3 つの生物学的複製からの）平均 WT 値の少なくとも 2 倍でなければなりませんでしたが、集団の場合、相対的な sdrM 適用範囲は（集団を考慮して）WT の平均適用範囲の少なくとも 1.3 倍でなければなりませんでした。異質性）。 各増幅タイプについて、新規ジャンクションの PCR 増幅とそれに続くサンガー配列決定によって少なくとも 1 つの例が検証されました。

補足図9に示すデータについては、sdrM、lmrS、sepA、およびrpoCの正規化カバレッジを、遺伝子にマッピングされたリードの合計を遺伝子長で割ったものとして計算しました。 次に、排出ポンプの正規化カバレッジを rpoC のカバレッジで割り、進化した分離株ごとに WT 値に正規化してカバレッジの倍率変化を取得しました。

臨床分離株については、ゲノムがコンティグに組み立てられているため、sdrM の適用範囲とそれを含むコンティグを比較しました。 コンティグ内の各塩基対のカバー深度は上記のように決定されました。 sdrM カバレッジの変化倍数は、sdrM の塩基対あたりのリード数をコンティグのリード数で割ることによって決定されました。 増幅を同定するための基準は、sdrM の相対的な範囲をそれぞれの親臨床分離株の値と比較することを除いて、上記と同じでした。

進化した分離株からゲノム DNA を抽出し、進化した対立遺伝子を PCR で増幅し、Gibson Assembly76 を使用して BamHI と EcoRI で消化した pIMAY* にクローニングしました。 構築されたプラスミドを大腸菌IM08B77からエレクトロポレーションおよび抽出した後、プラスミドのメチル化プロファイルが黄色ブドウ球菌と一致した。 プラスミド抽出はQiagen Plasmid MIDIキットを使用して行い、プラスミドはSavant SpeedVac SPD1030を使用して濃縮しました。 対立遺伝子置換は、記載されているように黄色ブドウ球菌 JE2 で実行されました 76。 簡単に説明すると、プラスミドを黄色ブドウ球菌 JE2 細胞にエレクトロポレーションし、LB 寒天 + クロラムフェニコール上に 30 °C でプレーティングしました。 形質転換したコロニーを、LB培地+クロラムフェニコール中、37℃で振盪しながら2晩増殖させ、最初の一晩後、新鮮な培地に1:1000に希釈した。 翌日、細胞をLB寒天+クロラムフェニコール上にプレーティングし、補足表2に記載されている組込みプライマーを用いたPCRによってコロニーの組込みをテストしました。 プラスミドの切除のために、組込みを示したコロニーを25℃で振盪しながらLB培地中で増殖させました。 2 晩かけて、最初の一晩後に 1:1000 倍に希釈します。 次いで細胞を０．４％ＰＣＰＡを含むＬＢプレート上にプレーティングし、コロニーをサイズに基づいてスクリーニングし、より大きなサイズはプラスミドの切除を示すものとみなした。 60 ～ 100 個の大きなコロニーを、クロラムフェニコールを含むまたは含まない LB プレートに画線培養して、クロラムフェニコール感受性クローンを同定しました。 変異対立遺伝子の存在は、配列決定プライマーを使用したサンガー配列決定によって確認されました（補足表2を参照）。

63,986 個の黄色ブドウ球菌分離株のゲノム アセンブリが、2023 年 1 月 19 日にアクセスされた NCBI 病原体検出データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/) からダウンロードされました。FASTA 配列は連結され、ローカル BLAST データベースは、NCBI BLAST v2.13.0+ makeblastdb コマンド 78 を使用して作成されました。 JE2 SdrM 配列のタンパク質配列は、ローカル データベースでの tblastn (翻訳された BLAST) 検索のクエリとして使用され、出力は、100% のカバー率、85% を超える同一性パーセント、および E 値を持つすべてのヒットについて解析されました。 < 10−6。 すべての位置のアミノ酸頻度は tblastn BTOP 出力から定量化され、補足データセット 3 に示されています。

過剰発現株を構築するために、WT 遺伝子および sdrM 変異対立遺伝子を PCR によって増幅し、Gibson アセンブリを使用して PCR 増幅した pKK30 ベクターにクローン化しました。 ギブソンで組み立てた生成物を大腸菌 DH5α λ-pir エレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションし、LB 寒天 + トリメトプリム プレート上で回収しました。 プラスミドを大腸菌株から抽出し、黄色ブドウ球菌RN4220にエレクトロポレーションしました。 プラスミドをもう一度抽出し、黄色ブドウ球菌 JE2 にエレクトロポレーションしました。

細胞を2mlのM63中で16時間増殖させた。 これらの細胞 2 μl を、96 ウェル プレート内の 198 μl の M63 + 0.1 μg/ml DLX に添加しました。 DLX の蛍光 (励起波長と発光波長はそれぞれ λexc = 395 nm と λem = 450 nm)、および OD600 を 30 分ごとに 19.5 時間測定しました。 バックグラウンドの測定値は、DLX なしまたは 0.1 μg/ml DLX を含む M63、および DLX なしまたは 0.1 μg/ml DLX を含む M63 単独の細胞について取得されました。 生の蛍光は細胞の存在下でのみ見られたため（補足図4a）、これは細胞内のDLX蓄積を示している可能性が高く、細胞内DLXの代理として使用できます。 サンプル間の比較を可能にするために、細胞密度に対して蛍光を正規化し、培地と細胞の自己蛍光を差し引きました。 正規化された蛍光 (蛍光/OD600) は次のように計算されました。

最初は細胞密度が非常に低く、細胞は誘導期にあるため、初期の時点での正規化された蛍光は、分母項の値が低いため、高い変動を示します。 したがって、図では最後の 12.5 時間のデータを示しています。

DLX 流出速度を決定するために、細胞内の DLX 濃度の増加のみを捉える単純化された数学モデルを検討しました。 sdrM 変異の選択、および DLX 耐性に対する sdrM 過剰発現の影響を考慮して、DLX 流出は主に SdrM 活性に依存していると仮定しました。 さらに、SdrM は排出ポンプであり、DLX の代謝や分解に影響を与える可能性は低いため、これらのプロセスはテストした菌株間で同様であるはずであり、したがってこれらをモデルには含めませんでした。 次の微分方程式を定義しました。

ここで、Cin は時刻 t におけるセル内の DLX 濃度、ρin はセル内への DLX の流入速度、Cout は時刻 t におけるセル外の DLX 濃度、ρout はセルからの DLX の流出速度です。 A = Cout (t = 0) は実験に使用した初期 DLX 濃度、0.1 μg/ml (~0.226 μM) です。 DLX のバインドとバインド解除は非常に高速に行われると想定しており、簡略化するために方程式では考慮していません。 上記の 2 つの方程式を解くと、次のようになります。

この 2 次の線形常微分方程式を Cin (t = 0) = 0 と積分すると、次のようになります。

ここで、B は任意の定数です。 流出アッセイで測定した正規化蛍光は Cin の代用であったため、流出速度がSdrM が存在せず、細胞内外への DLX の輸送は受動的であるため、トランスポゾン変異体の流入速度 ρin = ρout と等しくなります。 B と ρin の最適値は他の株でも同じであると仮定されました。 これらの値を代入して、WT、sdrM1*、sdrM2*、および sdrM3* の最小二乗フィットを実行して、各菌株の流出速度 ρout の最適値を決定しました。 Cin を正規化された蛍光に当てはめているため、流入速度と流出速度の単位は任意の単位/時間 (時間) でした。

DLX を Corning 96 ウェル平坦透明底プレートで 2 倍に連続希釈して、8 つの濃度を得ました。 M63 培地またはミュラー ヒントン ブロス 2 (MH2) で一晩増殖させた細胞を、最終希釈 1:5000 で段階希釈した抗生物質を含む 96 ウェル プレートに移し、37 °C で振盪しながら 24 時間増殖させました。 増殖後、Biotek Synergy H1 マイクロプレート リーダーを使用して、すべてのウェルの OD600 を測定しました。 すべての DLX 濃度の OD600 測定値を DLX 濃度値に対してプロットし、修正ゴンペルツ関数に当てはめて正確な MIC 値を決定しました 79。 多剤MICを決定するために、WTを1×ACGUを補充したMH2ブロス中で増殖させ、1.7aを2μg/ml DLXの存在下または非存在下で1×ACGUを補充したMH2中で一晩増殖させた。 翌日、３晩すべてを１×ＰＢＳで２回洗浄し、すべての抗生物質のＭＩＣを測定した。 ピリミジン合成に関与する遺伝子であるpyrCが1.7aにフレームシフト変異を有しており、1×ACGU添加なしでは生育不良を引き起こしたため、1.7aを用いた実験ではMH2培地に1×ACGUを添加した。

ゲノムDNAを上記のように抽出した。 Total RNA Purification Plus Kit (Norgen Biotek Corp) を使用して M63 で一晩増殖させた細胞から RNA を抽出し、TURBO DNA-free™ Kit (Invitrogen) を使用して DNA を除去しました。 cDNAは、ランダムプライマーおよびSuperscript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific)を使用して合成しました。 ゲノム DNA または cDNA サンプルを、Microamp EnduraPlate Optical 384 Well Clear Reaction Plate (Thermo Fisher Scientific) および qPCR または RT-qPCR 内でプライマー (補足表 2 を参照) および Applied Biosystems Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific) と混合しました。 、それぞれ、QuantStudio 5 リアルタイム PCR マシン (Thermo Fisher Scientific) で実行されました。 rpoC 遺伝子は、qPCR と RT-qPCR80 の両方のハウスキーピング コントロールとして使用されました。

各株の12個の独立したコロニーを、200μlの新鮮なM63を含む96ウェルプレートに37℃で24時間振盪しながら接種した。 翌日、それぞれの10μlを、それぞれのDLX MIC（0.32μg/mlのsdrM::Tn、0.55μg/mlのWT、1μg/mlのsdrM1*およびsdrM2*）を2.5倍含む新鮮なM63 190μlに接種した。 ml、および 1.75 μg/ml の sdrM3*) を使用し、振盪しながら 37 °C で 23 時間増殖させました。 23 時間後、OD600 を測定し、各ウェル 10 μl を、190 μl の新鮮な M63 および DLX を含む 96 ウェルプレートに移し、これを 5 ～ 14 日間繰り返しました。 WT 株と sdrM::Tn 株の進化（データは図 5e に示す）では、5 日目後に移植せずに集団をさらに 24 時間増殖させ、追加の増殖と進化を可能にする可能性があり、それらの間の比較を可能にしました。 2つの株。 OD600 ≥ 0.400 を持ち、実験の終了まで一貫してこの増殖を維持した集団は、耐性として分類されました。 どのウェルでも 3 日間連続して増殖が見られなかった場合、実験は中止されました。

1日目に、菌株を新鮮なM63培地に接種し、DLXなしで振盪しながら37℃で24時間増殖させた。 2日目に、抗生物質やDLXを含まない適切な濃度の新鮮な培地を含むチューブ内で細胞を1000倍に希釈しました。 同じプロセスを 3 日目にも繰り返し、各菌株について 2 つの反復を行いました。 毎日ゲノム DNA が抽出され、全ゲノム配列決定が行われました。 sdrM コピー数は上記のように決定されました。

細胞を1×ACGUを補充したMH2ブロス中で一晩増殖させ、翌日、培養物の段階希釈物を、1×ACGUを補充した、DLXを含まない、または2μg/ml、1μgのDLXを含むMH2寒天プレート上にスポットした。 /ml、または0.5μg/mlで、37℃のインキュベーター内で一晩増殖させた。 翌日、コロニー形成単位を決定した。

細胞をM63中で一晩増殖させ、新鮮なM63で1:2500に希釈し、200μlを96ウェルプレートに移した。 プレートを Biotek Synergy H1 マイクロプレートリーダー内で 37 °C で 807 サイクル/分で連続振盪しながらインキュベートし、プレートの OD600 を 30 分ごとに 24 時間測定しました。 細胞密度を測定するために、一晩培養したものの段階希釈物をLB寒天プレート上にスポットし、37℃のインキュベーター内で一晩増殖させました。 翌日、コロニー形成単位を決定した。

統計テストと分析は、GraphPad Prism v8.4.3 で実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

SdrM の対立遺伝子変異性を分析するための黄色ブドウ球菌分離株のゲノム アセンブリは、NCBI 病原体検出データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/) からダウンロードされました。 この研究からの全ゲノム配列データは、BioProject PRJNA904786 に関連する NCBI Short Read Archive (SRA) に寄託されています。 ソースデータはこの文書で提供されます。

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全ゲノム配列決定ライブラリーの調製と配列決定についてはがん研究センター ゲノミクス コア、および pKK30 プラスミドの提供についてはボーズ研究室 (カンザス大学医療センター) に感謝いたします。 臨床分離株のゲノムの配列決定と組み立て、および SCCmec タイピングの支援については、Tiffany Zarrella に感謝します。 原稿に関するコメントについては Susan Gottesman、Gigi Storz、John Dekker、Khare 研究室のメンバーに感謝します。また、この作業全体を通じて議論と提案をしてくれた Gottesman、Ramamurthi、Khare 研究室のメンバーに感謝します。 この研究では、NIH ハイパフォーマンス コンピューティング Biowulf クラスター (http://hpc.nih.gov) の計算リソースを利用しました。 この研究は、NIH、国立がん研究所、がん研究センターの学内研究プログラムによって支援されました。

国立衛生研究所 (NIH) によって提供されるオープンアクセス資金。

分子生物学研究所、国立がん研究所、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、20892、米国

カリンガ・パヴァン・T・シルバ、ガネーシュ・サンダー、アヌパマ・カレ

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GS は独自の進化実験を実行し、KPTS は他のすべての実験を実行し、KPTS と AK がデータを分析して原稿を書き、AK が研究を監督しました。

アヌパマ・カレへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Tobias Bollenbach 氏、Theresa Fink 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Silva, KPT、Sundar, G.、Khare, A. 排出ポンプ遺伝子の増幅は、二重標的抗生物質に対する耐性のための複数の標的変異の必要性を回避します。 Nat Commun 14、3402 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38507-4

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受信日: 2022 年 12 月 7 日

受理日: 2023 年 5 月 5 日

公開日: 2023 年 6 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38507-4

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