ベースエディターとプライムエディターは、臨床上の約束を実現し始めます

EmendoBio の科学チームは、同社独自のプラットフォームを活用して、次世代の CRISPR ベースの治療法を開発しています。 ヌクレアーゼ発見プラットフォームを使用してゲノムの標的可能な範囲を拡大し、標的特異的最適化プラットフォームを使用して、高効率を維持し、オフターゲット効果を回避しながら、対立遺伝子特異的編集を含む高精度の遺伝子編集を可能にします。 同社は、これまで不治だと考えられていた多くの疾患に合わせて、オーダーメイドのヌクレアーゼやRNAガイドを設計できるとしている。

メアリーアン・ラバント著

2016年に遡ると、ハーバード大学のデビッド・リュー博士率いる研究者グループは、塩基編集の開発を報告する論文をNatureに発表した。 彼らは、塩基編集は「二本鎖DNA骨格の切断やドナーテンプレートを必要とせず、プログラム可能な方法で、ある標的DNA塩基を別の標的DNA塩基に直接不可逆的に変換できるゲノム編集への新しいアプローチ」であると書いている。 彼らは、塩基編集によりオフターゲット変異のリスクを軽減できる可能性があり、「ヒトの疾患に関連するさまざまな点変異を効率的に修正できる」可能性があると付け加えた。

当時同様の研究が、神戸大学の西田啓二博士とその同僚によって達成されました。 それ以来、多くの追加の塩基編集システムが学術研究者や商業研究者によって開発されてきました。 それだけではありません。 2019年には、二本鎖DNAの切断を回避できるさらに別のゲノム編集システムが導入された。 このシステムはプライム編集と呼ばれ、Liu 率いる研究者によって開発されたのは偶然ではありません。

「[プライム編集は] 遺伝子操作された逆転写酵素に融合した触媒機能が低下した Cas9 エンドヌクレアーゼを使用して、指定された DNA 部位に新しい遺伝情報を直接書き込む、多用途かつ正確なゲノム編集方法であり、両方を指定するプライム編集ガイド RNA (pegRNA) でプログラムされています。標的部位を特定し、必要な編集をエンコードする」と研究者らは『Nature』誌に書いた。 「プライム編集は…塩基編集と比較して相補的な長所と短所を持ち、既知の Cas9 オフターゲット部位では Cas9 ヌクレアーゼよりもはるかに低いオフターゲット編集を引き起こします。プライム編集はゲノム編集の範囲と機能を大幅に拡大し、原理的には修正することができます」既知の遺伝的変異の 89% がヒトの病気に関連している。」

現在、臨床応用のためのベース編集システムとプライム編集システムが開発中です。 この記事では、そのようなシステムのいくつかを取り上げます。 これらのシステムは最先端、またはむしろ最先端ですが、パッケージングやターゲットを絞った配送などの身近な課題に依然として対処する必要があります。

「プライム編集機械は遺伝的変化を起こすために 3 つのアニーリング ステップを経る必要があるため、プライム編集は非常に特異的で正確であると私たちは信じています」とプライム メディシンの社長兼 CEO であるキース ゴテスディーナー医学博士は述べています。 「間違った場所に着陸して、3 つの鍵すべてのロックが解除される可能性は低いです。」

Gottesdiener 氏によると、プライム編集は 12 の異なる単一塩基対のミスマッチを修正し、小さなインデル変異を修復し、大きなゲノム配列を削除および置換することができ、すべてプログラム可能な方法で行うことができます。 「プログラム可能な編集では、編集は正確にターゲットを絞ったものになります」と彼は強調します。 「編集を行いたい塩基対を選択することができます。そして、機械が作動し、小さな gRNA によって誘導されるため、それを交換してゲノム内の別の場所に移動することができます。」

プライム編集は、急速に分裂している、または静止している膨大な数のセルで機能します。 一度の治療で、DNA は正常な遺伝子座の野生型に戻されます。

「私たちはオリジナルのテクノロジーを強化し、改良しました」と Gottesdiener 氏は主張します。 「それは本当であるにはあまりにももったいないことです。」 ただし、「このテクノロジーをどのサイトにも提供するには、他のサイトで見られているのと同様の課題がある」と彼は警告します。 よく知られた送達オプションには、ex vivo アプリケーション用のエレクトロポレーションが含まれます。 肝臓を標的とする脂質ナノ粒子（LNP）。 および他の戦略的場所を標的とするアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクター。

Prime Medicine には幅広いパイプラインがあります。 このようなパイプラインは企業に幅広い選択肢をもたらしますが、同時に経営上の課題も引き起こします。 「すべての症状がクリニックに運ばれる可能性があります」と Gottesdiener 氏は指摘します。 「しかし、一部のプログラムはより早く進行し、一部のプログラムは提携し、他のプログラムは廃止されるでしょう。」

初期パイプラインでは、即時適応と差別化プログラムに重点が置かれています。 プライムは、定義された遺伝学、新たな医療の優先事項、プライムのソートリーダーパートナーからの意見、規制および提供上の課題などの考慮事項のバランスをとった上で、これらの適応症を選択しました。 鑑別プログラムは、筋萎縮性側索硬化症の一種であるハンチントン病や一部の運動失調に見られる反復拡大への取り組みなど、独特の疾患特性に焦点を当てています。 プライムは2024年に最初の適応症である慢性肉芽腫性疾患についてINDを提出する予定だ。

Beam Therapeutics 社社長の Giuseppe "Pino" Ciaramella 博士は、塩基編集によって CRISPR ベースの技術が 2 つの重要な方法で変更されると観察しています。 まず、塩基編集では、ゲノムの再構成やその他の望ましくない結果を引き起こす可能性がある二本鎖の切断を行う必要がありません。 第二に、塩基編集では通常、CRISPR タンパク質を追加のヒトタンパク質、つまり遺伝子上で 1 つの核酸塩基を別の核酸塩基に化学的に直接変換できるデアミナーゼと融合させます。

塩基エディターの制限は、特定の種類の単一塩基対編集のみを実行することです。 つまり、それらは転移突然変異 (プリンからプリン、またはピリミジンからピリミジン) のみを実行でき、転換突然変異 (プリンからピリミジン、またはピリミジンからプリン) は実行できません。 これらを使用して、挿入や欠失を実行したり、必要な DNA を置き換えたりすることはできません。 それにもかかわらず、塩基エディターは転移点突然変異を高精度かつ効率的に作成できるツールであるため、さまざまな治療用途での可能性を秘めています。

二本鎖切断がないため、複数の同時編集が可能になり、大きな利点が得られます。 これらの同時編集を利用するシステムの 1 つは、Engineered Stem Cell Antibody Pared Evasion (ESCAPE) と呼ばれる Beam プラットフォームです。 抗体ベースのコンディショニングと多重遺伝子編集された造血幹細胞を組み合わせます。

「鎌状赤血球症の修飾を目的とした編集だけでなく、編集されていない細胞を選択的に標的にし、編集された細胞がその後に生着できるように骨髄にニッチを作り出すことができる特注の抗体に対して編集された細胞を耐性にする編集も行うことができます。移植です」とシアメラ氏は説明する。 これにより、不妊症やその他の副作用を引き起こす可能性がある現在の標準治療レジメンとは異なり、毒性のないコンディショニングレジメンが可能になる可能性があります。

同社は、臨床的に検証された配信技術を使用して、エディターをコードする mRNA を配信します。 Ex vivo プログラムではエレクトロポレーションを使用し、in vivo プログラムでは肝臓を標的とすることができる LNP に mRNA をカプセル化します。 免疫細胞や骨髄の幹細胞などの他の組織を標的とする新しい LNP 製剤が開発されています。

鎌状赤血球症に対するビームの主力プログラムである BEAM-101 は、米国初の臨床ベース編集プログラムです。 Ciaramella 氏は、Beam の規制パッケージは他の体外遺伝子編集プログラムに必要な規制パッケージと一致していると指摘しています。

Beam は、基本的な編集技術の開発に加えて、他の企業とのコラボレーションも行っています。 Prime Medicine との契約により、Beam は、鎌状赤血球症の治療だけでなく、一塩基遷移変異の作成または修正のためのプライム編集技術を開発する独占的権利を有します。 また、Beam は Verve Therapeutics と協力しています。 この提携により、Verve は特定の心臓血管標的に対する人間の治療用途のための Beam の塩基編集、遺伝子編集、および送達技術に独占的にアクセスできるようになります。 ビーム社はRNA編集技術にもアクセスできるが、同社はRNA編集がDNA編集よりも利点をもたらす用途をまだ見つけていないとシアラメラ氏は言う。

心臓専門医で科学者のセカール・カティレサン医師は、ヒト遺伝学の研究から明らかになった心血管疾患に関する 3 つの洞察を強調しています。 まず、血中コレステロール値が生涯を通じて低い場合、心臓発作を発症する可能性は非常に低くなります。 第二に、心臓病に抵抗力のある人の中には、コレステロール上昇遺伝子を自然に無効にする突然変異、つまり抵抗性突然変異を持っている人もいます。 第三に、耐性変異のうち 3 つは低密度リポタンパク質 (LDL) コレステロール経路に影響し、そのうち 4 つはトリグリセリドリッチ リポタンパク質 (TRL) コレステロール経路に影響し、そのうちの 1 つはリポタンパク質 (a) (Lp(a)) に影響します。コレステロール経路。

「CRISPR テクノロジーにより、これらの自然の耐性変異を模倣する医薬品の開発が可能になりました」と Kathiresan 氏は続けます。 「私たち」とは、彼が共同創設者兼 CEO を務める遺伝子医薬品会社 Verve Therapeutics の開発チームを意味します。 「私たちのかつて完成した遺伝子編集薬は、血中コレステロールを永久に下げるように設計されている」と彼は断言する。

同社の最も先進的な製品候補であるVERVE-101は、PCSK9遺伝子を標的としてLDLコレステロール値を低下させます。 同社の次に先進的な製品候補であるVERVE-201は、ANGPTL3遺伝子を標的にしてTRLコレステロール値を低下させる。 VERVE-101 プログラムと VERVE-201 プログラムはどちらも、基本的な編集テクノロジーに依存しています。 LPA 遺伝子をターゲットにして Lp(a) コレステロール値を下げるために、Verve はカスタム エディターを設計しています。

配信には改良による利点があります。 標準的な LNP は、貨物を運ぶ小さな脂肪の泡です。 VERVE-101 の場合、カーゴは CRISPR ベース エディターの mRNA と、エディターを PCSK9 遺伝子に導く gRNA です。 「標準的な LNP にリガンドである GalNAc 糖分子を追加しました」と Kathiresan 氏は言います。 「GalNAc受容体は肝細胞でのみ発現されるため、GalNAc LNPはより強力で特異的になる可能性があります。」

VERVE-101 は現在、高コレステロールおよび早発性心疾患の遺伝的形態であるヘテロ接合性家族性高コレステロール血症 (HeFH) の患者における安全性と有効性を評価する、heart-1 と呼ばれる第 I 相試験中です。 病的疾患である HeFH は、血中 LDL コレステロール濃度の重篤な上昇と、早発性アテローム性動脈硬化性心血管疾患を特徴としています。 毎日の錠剤または断続的な注射による現在の LDL コレステロール低下療法は、患者、医療従事者、医療システムに大きな治療負担を課しており、世界中で LDL コレステロール目標レベルに達している HeFH 患者は 5% 未満です。

heart-1 試験は現在、ニュージーランドと英国で登録中です。 臨床データは今年後半に発表される予定です。 同社は米国でのIND開設に向けてFDAと協力している。

CRISPR-Cas9 テクノロジーの臨床応用では、安全性と柔軟性を実証する必要があると、Emenendo Biotherapeutics の社長兼 CEO である David Baram 博士は述べています。 同氏によれば、安全性とは主に、ターゲット外の影響を回避することの問題だという。 「CRISPR-Cas9は、カットしたいものを主にターゲットにしています」とバラム氏は言う。 「しかしほとんどの場合、野生型では安全性が十分ではありません。」 柔軟性に関して、彼は複数のソリューションの必要性を強調しています。「最も効果的な方法で疾患を治療できるようにするために、編集戦略のポートフォリオにより、より多くの疾患や特定の遺伝子上の遺伝子座をターゲットにすることが可能になります。」

おそらく、遺伝子編集で最もよく知られているヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌から単離された Cas9 バリアント (SpCas9) です。 ただし、他にも何千ものヌクレアーゼがあり、その中には活性、標的にできる部位の数、特異性、パッケージング効率の点で優れているものもあります。 ヌクレアーゼのパネルは、特定の疾患の治療に最適なヌクレアーゼを見つけるオプションを提供します。 「当社のヌクレアーゼは活性が高く、非常に正確であり、ヒトゲノムの 90% を標的にすることができます」と Baram 氏は主張します。 「SpCas9 がカバーするのは 10% 未満です。」

計算の専門家と科学者のチームがヌクレアーゼのパネルを生成します。 同社のエンジニアリング プラットフォームは、これらの野生型ヌクレアーゼを特定の目的に適応させます。 一例は、1 つの健康な対立遺伝子と 1 つの変異した対立遺伝子が存在する常染色体優性疾患の対立遺伝子特異的編集です。 「わずかな一塩基の違いしかない場合でも、変異した対立遺伝子を標的にすることができます」とバラム氏は述べています。 これにより、常染色体優性疾患をワンステップで治療できる道が開かれました。

エメンド氏の主な適応症は重度の先天性好中球減少症で、最終的には免疫不全を引き起こし、患者が細菌感染症に非常に敏感になる好中球成熟障害である。 この病気の標準治療には、免疫系機能の回復に役立つ顆粒球コロニー刺激因子の注射が含まれます。 この病気を治療し、できれば治癒するために、Emenendo 氏は新しい CRISPR ベースの ex vivo 遺伝子編集戦略 (OMNI A1) を開発しました。これには、病気の原因となる ELANE 遺伝子の変異対立遺伝子の特異的切除が含まれます。 エメンド氏は、2023年末までにそれを診療所に導入する予定だ。

家族性高コレステロール血症の治療法も開発中です。 この治療法では、PCSK9 遺伝子 (LDL 受容体発現を調節するタンパク質をコードする) ではなく LDLR 遺伝子 (LDL 受容体をコードする) を標的にして、肝細胞表面の LDL 受容体の発現レベルを上昇させ、肝細胞から LDL コレステロールを取り込みます。細胞に血液が入ります。 この編集戦略は、膜表面上の LDL 受容体の発現レベルに直接影響を与える LDLR 遺伝子内の調節要素を切除します。 データによると、このアプローチを使用すると、PCSK9 のノックアウトとスタチンの投与を組み合わせた場合よりも、LDL 細胞摂取レベルが 3 倍上昇します。

Revvity for Life Sciences の Pin-point™ Base Editing Platform には、次の要素が組み込まれています。 ニッカーゼ（二本鎖 DNA の切断を避けるための Cas9 または同様のタンパク質に基づく）。 そしてデアミナーゼ（または別のエフェクター分子）。 このシステムは、gRNA 上のアプタマーと、デアミナーゼまたは他のエフェクター分子上のアプタマー結合タンパク質を使用して構築されます。

Pin-point ベース編集プラットフォームと他のベース編集システムの違いは何ですか? Pin-point Base Editing Platform では、デアミナーゼとニッカーゼは融合しません。 さまざまなデアミナーゼとニッカーゼを個別に交換できます。

「アプタマーなしで gRNA を使用することで、nCas9 のニッキング機能を標的にして、ゲノム内の標的部位に DNA 配列を挿入することが可能になります」と Revvity の Pin-point Base Editing Platform ビジネスユニットマネージャーの Michelle Fraser 博士は説明します。ライフサイエンス向け。 「これにより、多重編集が可能になり、遺伝子のノックアウトや一塩基レベルでの遺伝的エラーの修正が可能になり、同時に遺伝子の挿入も可能になります。」

Pin-point Base Editing Platform は、T 細胞内の 4 つの異なる免疫原性遺伝子座 (B2M、CD52、PDCD1、および TRAC) の多重編集でシトシン塩基エディターを使用して、C から T への > 75% の塩基変換を達成しました。 これら 4 つの遺伝子座すべてが、編集された細胞集団の 50% 以上でノックアウトされました。

Pin-point Base Editing Platform は、これらの同じ 4 つの免疫原性マーカーがノックアウトされ、CD19 を標的とする CAR がノックインされたキメラ抗原受容体 (CAR) T 細胞の生成にも使用されました。腫瘍細胞死滅アッセイにより、これらの細胞が存在することが確認されました。 CAR T細胞は非常に効果的でした。 多重塩基編集は、同様の効率で人工多能性幹細胞でも実証されています。

Pin-point Base Editing Platform は、Revvity for Life Sciences からライセンスを取得できます。 さらに、タイル スクリーニング サービスも利用できます。このサービスでは、Pin-point プラットフォームを使用して、対象遺伝子内の利用可能なすべての C 残基を編集します。 次に、編集された細胞の表現型を使用して、機能ドメインを特定したり、疑わしい遺伝的変異を特徴付けたりします。

Cas 変異体、ニッカーゼ、デアミナーゼ、その他のエフェクターなどの一連の酵素は、生物多様性のソースを対象とした酵素発見プログラムや、研究室ベースのタンパク質工学および指向性進化プロジェクトを通じて急速に拡大しています。 Revvity for Life Sciences によると、Pin-point Base Editing Platform のモジュール性により、ニッカーゼやデアミナーゼを新しく開発されたバリアントに置き換えるユニークな機会が提供されます。

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