アルファをノックアウト | 遼寧海岸ワイズパートナーズ株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9243 (2023) この記事を引用

127 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

パーキンソン病 (PD) 関連タンパク質であるα-シヌクレイン (α-syn/SNCA) は、悪性黒色腫で高度に発現しています。この研究の目的は、黒色腫の発症におけるα-syn の関与の可能性のあるメカニズムを明らかにすることでした。ここで我々は、α-syn が発癌促進性接着分子 L1CAM および N-カドヘリンの発現を調節するかどうかを検討しました。 2 つのヒト黒色腫細胞株 (SK-MEL-28、SK-MEL-29)、SNCA ノックアウト (KO) クローン、および 2 つのヒト SH-SY5Y 神経芽腫細胞株を使用しました。黒色腫株では、α-syn 発現の喪失により、L1CAM および N-カドヘリンの発現が大幅に減少し、それに伴い運動性も大幅に低下しました。平均して、テストした4つのSNCA-KOでは、対照細胞と比較して運動性が75%減少しました。驚くべきことに、α-syn が検出できない神経芽腫 SH-SY5Y 細胞と、α-syn を安定的に発現する SH-SY5Y 細胞 (SH/+αS) を比較すると、α-syn の発現により L1CAM と単細胞運動性が 54% 増加することがわかりました。それぞれ597%と597%です。 SNCA-KOクローンにおけるL1CAMレベルの低下は転写効果によるものではなく、むしろ対照細胞よりもSNCA-KOクローンのリソソームにおいてL1CAMが効率的に分解されることが判明した。 α-syn は細胞膜への L1CAM の細胞内輸送を促進するため、α-syn は黒色腫 (おそらく神経芽腫) の生存を促進すると考えられます。

黒色腫は、メラノサイトと呼ばれる色素生成細胞から発生する進行性の皮膚がんです。疫学研究では、黒色腫とパーキンソン病 (PD) の同時発生が報告されています 1,2。黒色腫は制御されない細胞増殖を特徴とするのに対し、PDは神経細胞死を特徴とするという点で、これら2つの疾患が大きく異なるため、このような同時発生は珍しい。黒色腫患者は、年齢と性別が一致した対照群と比較して PD を発症するリスクが 1.5 ～ 1.85 倍高く 3,4、逆に、PD 患者は浸潤性黒色腫を発症するリスクが対照群より 1.4 ～ 20 倍高い 5 、6、7。この共発生のメカニズムは不明であり、複数の遺伝子 2 (そのうちの 1 つは SNCA)、さらには環境要因が関与している可能性があります。ここでは、黒色腫におけるSNCAの役割に焦点を当てます。

SNCA は、タンパク質 α-シヌクレイン (α-syn)8、9、10 をコードします。このタンパク質は、ニューロン 11、12、13 や、高度に発現している黒色腫 17 を含む他のさまざまな組織 14、15、16 で発現します。 α-Syn は、ニューロン内でシナプス小胞がドッキングしている神経終末に局在する、本質的に折り畳まれていない小さなタンパク質です 18。それは個々のエキソサイトーシス事象の動態を加速します19。 α-syn が他の細胞型でエキソサイトーシスを促進するかどうかは不明です。このユニークなタンパク質は、その多数の立体構造において非常に多くの生体分子、すなわち、負に荷電したリン脂質20、21、タンパク質22、23、24、およびDNA25に結合するため、他の多くの活性がこのユニークなタンパク質に帰せられる。したがって、α-syn はエンドリソソーム系でエンドサイトーシスとエキソサイトーシスを促進するように機能します 19,26 が、他の機能も持っている可能性があります。 α-syn は本質的に折り畳まれていない性質により、オリゴマーおよびプリオン様のアミロイド生成性立体構造に凝集する傾向が非常に高く 27、これらの凝集体の一部は PD の神経変性を引き起こす 28。逆説的ですが、α-syn のプリオン様凝集体は、黒色腫細胞の生存促進作用であるオートファジーを促進することが示唆されています 29。 α-syn が黒色腫において他の生存促進機能を持っているかどうかがこの研究の主題です。

2 つの研究では、SNCA のノックアウトが細胞の恒常性に及ぼす影響を評価しました。まず、マウス網膜上皮細胞の SNCA を in vitro でノックダウンすると、トランスフェリン受容体 (TfR1) とその mRNA 転写物のレベルが大幅に低下し、α-syn を過剰発現させると、対照細胞と比較して TfR1 タンパク質とその mRNA 転写物のレベルが増加しました 30,31。。網膜上皮細胞におけるα-syn発現の喪失により、TfR1分子がゴルジ小胞に蓄積するようになり、α-synがTfR1をトランスゴルジから細胞膜に通過させる経路に必要であることが示唆された30。第二に、ヒト皮膚黒色腫細胞株 SK-MEL-28 で SNCA がノックアウトされ、SNCA-KO クローンが in vitro およびマウス異種移植モデルで評価されました 31。これらの黒色腫細胞におけるα-syn発現の喪失は、TfR1および鉄輸送体フェロポーチンのレベルを低下させ、ヌードマウスに移植されたSNCA-KO腫瘍の増殖を有意に抑制した。 SNCA-KO クローンにおける TfR1 レベルの低下は、リソソーム分解の促進の結果でした。これら 2 つの研究の結果は、α-syn が TfR1 の小胞輸送を促進することと一致しています。

この研究では、α-syn の発現レベルが接着タンパク質の発現レベルに影響を与えるかどうかを確認しようとしました。具体的には、TfR1 とニューロンや黒色腫で発現する接着タンパク質である L1CAM が 3T3 細胞のエンドサイトーシス時に共局在することを考慮して 32、α-syn が TfR1 と同様に L1CAM の発現を調節するかどうかを調べました。この目的を達成するために、α-syn の発現の有無にかかわらず、黒色腫細胞および神経芽腫細胞における L1CAM のレベルを測定しました。さらに、上皮間葉移行 (EMT) に関与する 3 つのタンパク質である E-カドヘリン、N-カドヘリン、およびビメンチンのレベルも評価しました 33,34。 EMT は、上皮細胞が上皮マーカーと形態を脱ぎ捨て、間葉表現型に変換する、高度に制御された移行です。ただし、メラノサイト (および黒色腫) は上皮細胞ではないため、メラノサイトが EMT を受けると言うのは誤りです。我々は、黒色腫細胞株におけるα-synのノックアウトと神経芽腫細胞株におけるα-synの低発現が、α-synを発現する対照細胞と比較してL1CAMの有意な減少を引き起こすことを示す。これらの発見に対する我々の解釈は、α-syn は翻訳後に作用して高レベルの L1CAM を維持し、ひいては高レベルの運動性を維持するため、メラノーマの生存促進因子であるということです。

この研究で使用した細胞株を表 1 に示します。各黒色腫細胞株は、皮膚黒色腫で最も一般的な変異である BRAF V600E 変異 35 を保有しています (表 1)。この変異は、RAS-RAF-MEK-ERK シグナル伝達経路の構成的活性化を引き起こし 36、増殖を引き起こします。 SH-SY5Y 細胞は、PD37 の研究に広く使用されており、神経芽腫に由来します。

SK-MEL-28 コントロール細胞とその派生細胞を調べました (表 1)。 E-カドヘリン、L1CAM、N-カドヘリン、ビメンチン、α-syn、およびα-チューブリンのレベルは、ウエスタンブロッティングを使用して細胞抽出物中でプローブされました（図1A〜D;補足図S1およびS2）。ブロットの濃度分析からの正規化されたバンド強度を図 1E に示します。 SK-MEL-28 コントロール細胞と比較して、2 つの KO クローンでは、L1CAM、N-カドヘリン、およびビメンチンが 26% (P = 0.002)、35% (P = 0.005)、および 52% (P = 0.008) ダウンレギュレートされました。）、それぞれ。対照的に、E-カドヘリンのレベルは影響を受けませんでした（図1E）。クローン KI8 および KI9 は、対照細胞と同様にこれら 3 つのタンパク質のレベルを示しました。

α-syn の喪失により、SK-MEL-28 細胞の EMT 様マーカーと運動性が低下します。 (A – D) インビトロで培養したコントロール、KO、および KI 細胞のライセート中の E-Cad、L1CAM、N-Cad、ビメンチン、α-syn、および α-チューブリンの代表的なウエスタンブロット。 (E) 相対タンパク質レベルの定量分析。 E-Cad、L1CAM、N-Cad、およびビメンチンのバンド強度は、α-チューブリンに対して正規化されています。すべての実験は少なくとも 3 つの生物学的複製 (n = 3) で繰り返されました。 (F) 金コロイドでコーティングされたウェル上のコントロール、KO8、および KI8 細胞によって作成された貪食運動トラックの代表的な光学顕微鏡画像。黒い矢印は、それぞれの細胞株の個々の貪食運動の軌跡を示します。画像は 10 倍の対物レンズを使用して取得し、細胞あたりの透明な貪食領域を ImageJ ソフトウェアを使用して測定しました。 (G) 棒グラフは、3 つの独立した実験からの除去された領域の定量化を示します。実験条件ごとに少なくとも 33 トラックが定量化のためにランダムに選択されました。実験グループごとに n = 3 の 100 トラックが統計分析に使用されました。 (E、G) 値は平均値 ± SD **、p = 0.0015 ～ 0.0027。 *、p = 0.0073 ～ 0.0134 一元配置分散分析、ダネット事後検定を使用して決定。

SNCA-KO クローンは、浸潤と遊走に関連する L1CAM、N-カドヘリン、およびビメンチンの発現レベルが低いことを考慮して、KO クローンの運動性がコントロール細胞よりも低いかどうかを調べました。この目的を達成するために、我々は金コロイド単一細胞運動性アッセイ 38 を使用して、単一細胞の動きをモニタリングしました。細胞が金コロイドで覆われたスライドの表面を横切って移動すると、細胞は表面上の金が少ない場所に跡を残します。コントロール、KO8、およびKI8細胞の動きの代表的な画像を図1Fに示し、コントロール、KO9、およびKI9の動きの代表的な画像を補足図S3に示します。コントロール細胞は KO8 クローンよりもはるかに大きなトラックを作成し、KI8 クローンのトラックパターンはコントロールセルのパターンと似ていました。 ImageJ を使用してトラックの面積を測定し、結果を図 1G にプロットしました。 α-syn 発現の喪失により、KO8 と KO9 の単細胞運動性がそれぞれ 69% (P < 0.0001) と 73% (P < 0.0001) 有意に減少し、α-syn の再発現により運動性が回復し、コントロール細胞。

SK-MEL-28 コントロール、SNCA-KO、および SNCA-KI 細胞の浸潤および遊走の可能性は、ボイデンチャンバーを使用したトランスウェルアッセイによって測定されました 39。浸潤アッセイでは、上部チャンバーの無血清培地中の細胞がマトリゲルに侵入し、FBS を含む完全培地を含む下部チャンバーに移動する能力を測定します。遊走アッセイでは同じセットアップを使用しますが、マトリゲルは使用しません。 24 時間後、下部チャンバー内の細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、光学顕微鏡で画像化し、計数しました。対照、KO8、およびKI8を比較した遊走アッセイからの代表的な画像を図2Aに示します。コントロール、KO9、およびKI9の画像を補足図S3に示します。フィールドあたりの遊走細胞数は、コントロール細胞と比較してKO8細胞で有意な77%(P < 0.0001)の減少を示し、KI8はコントロール細胞と同じレベルのフィールドあたり遊走細胞数を示した(図2A、左側)プロット）。同様の結果がKO9およびKI9クローンでも見られた(図2A、右側のプロット)。対照、KO8、およびKI8を比較した浸潤アッセイからの代表的な画像を図2Bに示します。コントロール、KO9、およびKI9の画像を補足図S3に示します。フィールド当たりの浸潤細胞数は、コントロール細胞と比較して、KO8 細胞で 77% (P < 0.0001) の有意な減少を示し、KI8 はコントロール細胞と同じレベルの遊走細胞を示しました (図 2B、左側のプロット)。同様の結果がKO9およびKI9クローンでも得られた(図2B、右側のプロット)。

トランスウェルチャンバーアッセイにより評価すると、SNCA-KO は SK-MEL-28 細胞の遊走と浸潤を減少させます。遊走アッセイでは、無血清培地中の 1 × 105 細胞をトランスウェル (孔径 8 μm) 装置の上部チャンバーに播種し、膜を通って下部チャンバーに遊走させました。浸潤アッセイでは、アッセイ前に 50 μl のマトリゲル (0.2 mg/ml) を添加して薄いゲル層を形成し、その後、無血清培地中の 4 × 105 細胞を上部チャンバーに播種し、膜を介して浸潤させました。下のチャンバーへ。どちらの実験でも、下部チャンバー内の 50% FBS を含む DMEM 完全培地が化学誘引物質として機能しました。膜を通過した細胞をパラホルムアルデヒドで膜上に固定し、クリスタルバイオレットで染色した。 (A) 10×フィールドあたりの遊走したコントロール、KO8、およびKI8細胞(24時間後)の代表的な画像。合計 3 つの顕微鏡視野が各内膜からランダムに選択され、細胞が計数されてグラフに表示されました (n = 3 回の独立した実験)。 (B) 10×フィールドあたりの浸潤したコントロール、KO8、およびKI8細胞(24時間後)の代表的な画像。合計 3 つの顕微鏡視野が各内膜からランダムに選択され、細胞が計数されてグラフに表示されました (n = 3 回の独立した実験)。値は、一元配置分散分析、ダネット事後検定によって決定された平均 ± SD P 値です。

次に、SNCA-KO細胞では対照細胞と比較してL1CAMレベルが著しく低い理由を尋ねました。我々は、(i) L1CAM と α-syn がシナプス可塑性に関与しているため、L1CAM に焦点を当てました 40。 (ii) L1CAM は運動性に関与する腫瘍抗原として認識されます 41,42,43。 (iii) L1CAM は、3T3 線維芽細胞において TfR1 によってエンドサイトーシスされます 32。 (iv) TfR1 分子は、対照細胞と比較して、SNCA-KO 細胞のリソソーム内でより効率的に分解されます 31。我々は、α-syn が L1CAM を含むエンドサイトーシス小胞の細胞膜への、または細胞膜からの効率的な輸送を促進すると仮説を立てました。その結果、α-syn が存在しない場合、L1CAM 分子を含むエンドサイトーシス小胞の大部分が細胞膜に到達できず、代わりにリソソームに分流されて分解されます。少なくとも 4 つの経路がリソソームにつながります 44,45: (i) エンドソームからリソソームへの経路、(ii) 食作用経路、(iii) オートファジーからリソソームへの経路 (マクロオートファジー)、および (iv) シャペロン媒介オートファジー。以下の実験のデザインを考慮すると、オートファジーのマーカーも監視しましたが、エンドソームからリソソームへの経路を調査したと仮定します。

我々は、阻害剤バフィロマイシン A1 (baf)46 を使用して、リソソーム内の L1CAM 分子の分解をテストしました。 Baf はリソソームの酸性化を防ぐため、活性のために低い pH を必要とするリソソームプロテアーゼは不活性になります。 baf処理細胞でも小胞はリソソームと結合することができますが、そのカーゴタンパク質は分解できません。 α-syn 発現の非存在下で、L1CAM 分子を含むエンドサイトーシス小胞が分解のためにリソソームに分流される場合、baf はそのような分解をブロックするはずです。したがって、baf処理したSNCA-KO細胞におけるL1CAMのレベルは、対照細胞におけるものと同じであるはずである。細胞をジメチルスルホキシド（DMSO）またはbafで5時間処理しました。細胞溶解物は、ウェスタンブロッティングによってL1CAM、LC3-Iおよび-II、α-syn、およびα-チューブリンについてプローブされました（図3A;補足図S4およびS5）。 LC3 の脂質化型である LC3-II は、オートファジーが阻害されるとオートファゴソーム内に蓄積します。バンド強度は濃度測定によって定量化され、結果として得られたデータは正規化されて 2 つの方法で分析されました。

α-syn の喪失は、L1CAM のリソソーム分解を促進します。 (A) DMSO または baf で 5 時間処理したコントロール、KO および KI 細胞の溶解物中の L1CAM、LC3-I および -II、α-syn、および α-チューブリンのレベルのウェスタンブロット分析。示された細胞を 50 nM baf で 5 時間処理し、溶解物を示されたタンパク質についてプローブしました。バンド強度は濃度測定により定量化した。この実験は、n = 3 の生物学的複製に対して行われました。 (B) 未処理 (DMSO) 細胞と処理済み (baf) 細胞の溶解物中の L1CAM レベルのプロット。このプロットでは、L1CAM (L1) は (IL1/Itub) に従ってα-チューブリン (tub) に対して正規化されています。ここで、IL1 と Itub はそれぞれのバンドの平均強度です。 P 値は、片側スチューデント t 検定によって決定されました。 (C) 治療グループごとに比較した L1CAM レベルのプロット。このプロットでは、L1CAM は、(IL1/Itub) サンプル (Itub/IL1) コントロールに従って、α-チューブリンに対して正規化されました。 P 値は、ダネット事後検定を使用した一元配置分散分析によって決定されました。 (D) L1CAM の定量的 RT-PCR 分析。 L1CAM および SNCA の変化倍数における相対 mRNA レベルは、ハウスキーピング遺伝子 GAPDH に対して正規化されました。 P 値は、一元配置分散分析、ダネット事後分析によって決定されました (n = 3)。プロット (B ～ D) の値は平均値 ± 標準偏差です。

まず、片側 t 検定を使用して、未処理細胞と処理細胞の L1CAM レベルを比較しました。 5時間のbaf処理は、対照および2つのKIクローンにおいてL1CAMを増加させることができなかった(図3B)。対照的に、baf 処理は、KO8 および KO9 クローンにおいてそれぞれ L1CAM を 70% (P = 0.02) および 47% (P = 0.14) 増加させました。これらの結果は、5 時間にわたって、かなりの数の L1CAM 分子が KO8 クローンのリソソームで分解されましたが、対照細胞、KO9、および KI クローンでは分解されなかったことを示しています。

第二に、未治療群とbaf治療群のL1CAMレベルを個別に比較しました。この分析では、KO および KI クローンの L1CAM レベルを対照細胞に対して正規化しました。 DMSO グループでは、SNCA-KO クローンのそれぞれにおける L1CAM の発現は、コントロール細胞と比較して平均 50% 減少しました (P = 0.022 ～ 0.024) (図 3A、レーン 2 および 4 対 1、図 3C)。。対照的に、baf グループでは、L1CAM は対照細胞と比較して KO クローンの有意な減少を示さなかった (図 3A、レーン 8 および 10 対 7、図 3C)。

追加の対照実験は次のとおりです。 L1CAMは膜タンパク質であり、膜タンパク質はリソソームで分解されますが、プロテアソーム阻害剤MG132を使用して、L1CAMがプロテアソーム分解を受けないことを確認しました（補足図S6）。また、定量的 PCR (qPCR) を実行して、コントロールおよび KO クローンの L1CAM mRNA レベルをチェックしました。対照細胞と比較して、KO8 および KO9 細胞における L1CAM mRNA の減少に関する証拠は見つかりませんでした。代わりに、KO クローンにおけるこの転写物のわずかな増加が検出されました (図 3D)。総合した結果は、リソソームにおけるタンパク質の分解による SNCA-KO 細胞における L1CAM レベルの減少と一致しています。

我々は、ヒト皮膚細胞株 SK-MEL-29 の SNCA をノックアウトし、親細胞と 2 つの SNCA-KO クローン (表 1) を以下の実験に使用しました。ウエスタンブロッティングを使用して、細胞抽出物中のL1CAM、N-カドヘリン、ビメンチン、α-syn、およびα-チューブリンの発現を調べました（図4A、B;補足図S7、切り取られていないブロット）。 α-syn 発現の喪失により、対照細胞と比較して両方の SNCA-KO クローンで L1CAM の発現が 20% 減少し (図 4A、C)、N-カドヘリンが 20% 減少しました (図 4A、D)。しかし、ビメンチンには変化はありませんでした (図 4B、E)。 L1CAM および N-カドヘリン発現の減少はわずかでしたが、それにもかかわらず、4 つの変化のうち 3 つは統計的に有意でした。また、SK-MEL-29親細胞と2つのSNCA-KOクローンに対して金コロイド単一細胞運動性アッセイを実施しました。対照細胞は2つのKOクローンのいずれよりもはるかに高い運動性を有しており、対照およびKO1のトラックの画像を図4Fに示し、KO2のトラックを補足図S7に示します。単一細胞トラックの定量化された領域のプロットは、各 KO クローンの運動性の 80% 減少 (P < 0.0001) を示しました (図 4G)。

α-syn の喪失は、SK-MEL-29 細胞の L1CAM と N-カドヘリン、および運動性を低下させます。 (A) in vitroで培養したコントロールおよびα-syn KO細胞の溶解物中のL1CAM、N-Cad、α-syn、およびα-チューブリンの代表的なウェスタンブロット。 (B) ビメンチン、α-syn、α-チューブリンの代表的なウェスタンブロット。 α-チューブリンに対して正規化された、L1CAM (C)、N-Cad (D)、およびビメンチン (E) の相対タンパク質レベルを示す定量データ。すべての実験は、少なくとも 3 つの生物学的複製 (n = 3) で繰り返されました。 (F) 金コロイドでコーティングされたウェル上のコントロールおよび KO α-syn 細胞によって作成された貪食運動トラックの代表的な明視野顕微鏡画像は、10 倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用して取得されました。黒い矢印で表される個々の貪食運動トラックは、ImageJ ソフトウェアを使用して測定され、(G) で表されます。実験条件ごとに少なくとも 33 トラックが定量化のためにランダムに選択されました。統計分析には、実験グループごとに n = 3 の合計 100 トラックが使用されました。プロット (C ～ E、G) の値は平均 ± SD P 値は、一元配置分散分析、ダネット事後検定によって決定されました。

α-syn 発現の喪失により 2 つの黒色腫細胞株における L1CAM、N-カドヘリン、および細胞運動性が低下することを考慮して、我々はその逆が当てはまるかどうかを尋ねました。α-syn 発現を欠く細胞で α-syn を発現させると、発癌促進性接着タンパク質とそれに付随して細胞運動性を増加させる？この考えを検証するために、α-syn が検出できないヒト神経芽腫細胞株 SH-SY5Y と、野生型 α-syn を安定して発現する SH-SY5Y 細胞 (SH/+αS) を使用しました (表 1)。細胞抽出物中の L1CAM、N-カドヘリン、ビメンチン、α-syn、および GAPDH レベルをウェスタンブロッティングによってプローブし (図 5A; 補足図 S8、切り取られていないブロット)、以下の結果が得られました。第一に、α-syn は SH/+αS 細胞で強力に発現されましたが、親株では発現されませんでした (図 5A、パネル 4)。第二に、L1CAMレベルのレベルは、親細胞よりもSH/+αS細胞において54%(P = 0.044)高かった(図5A、パネル1;図5B)。第三に、N-カドヘリンレベルは 2 つの細胞株で同様でした (P = 0.508) (図 5A、パネル 3、図 5B)。第四に、ビメンチンのレベルは、親細胞よりもSH/+αS細胞において415%(P = 0.001)高かった(図5A、パネル2;図5C)。

SH-SY5Y細胞でα-synを発現させると、L1CAMと運動性が増加します。 (A) インビトロで培養したコントロールおよび SH/αS 細胞の溶解物中の L1CAM、ビメンチン、N-Cad、α-syn、および α-チューブリンの代表的なウェスタンブロット。相対的なタンパク質レベルを表す定量分析は、L1CAM、N-Cad (B)、およびビメンチン (C) のバンド強度をα-チューブリンに対して正規化することによって測定されました。すべての実験は、少なくとも 3 つの生物学的複製 (n = 3 ～ 6) で繰り返されました。 (D) 金コロイドでコーティングされたウェル上のコントロールおよびα-syn 過剰発現 SH-SY5Y 細胞によって作成された貪食運動トラックの代表的な明視野顕微鏡画像。画像は、10 倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用して取得されました。黒い矢印で表される個々の貪食運動トラックは、ImageJ ソフトウェアを使用して測定され、(E) に表されます。実験条件ごとに少なくとも 33 トラックが定量化のためにランダムに選択されました。統計分析には、実験グループごとに n = 3 の合計 100 トラックが使用されました。プロット (B、C、E) の値は平均 ± SD P 値は両側スチューデント t 検定によって決定されました。

2 つの SH-SY5Y 細胞株の単一細胞運動性も測定しました。 SH/+αS 細胞は、親細胞と比較して、24 時間のインキュベーション期間中に堅牢な単一細胞運動性を示しました (図 5D)。単一細胞トラックの定量化された領域のプロットは、SH-SY5Y 細胞で α-syn を発現させると、対照細胞と比較してそのような細胞の単一細胞の運動性が大幅に増加したことを示しています。驚くべきことに、SH/+αS 細胞は、親細胞と比較して単一細胞の運動性において 597% (P < 0.0001) の増加を示しました (図 5E)。

40 年前に行われた古典的な実験では、ヒト肝癌細胞株におけるトランスフェリンとトランスフェリン受容体の内部移行の動態が精緻に説明されています 47,48。これらのグループの 1 つは、リソソームへのデフォルト経路を持つ内部移行とリサイクルのモデルさえ提案しました 48。彼らのモデルは、現在の研究にとって優れたモデルです (参考文献 48 の図 7 を参照)。私たちは現在、TfR と L1CAM がそれぞれサイトゾルのエンドサイトーシスのリサイクリング配列 32,49 を持ち、それぞれがリサイクリング配列に結合するクラスリンアダプタータンパク質である AP-2 に結合し、それぞれがクラスリン媒介エンドサイトーシスを受ける 32,50 ことを知っています。図 6A のモデルで捉えられているように、クラスリン媒介内在化中に共局在します 32。

受容体リサイクリングに対するα-synの効果の提案されたモデルとシミュレーション。 (A) 左側のパネル: α-syn が、L1CAM および TfR を含む内在化小胞の細胞膜への輸送を加速するモデル。右側のパネル: α-syn 発現の喪失により、細胞膜上の L1CAM および TfR が減少するモデル。 (B) 小胞輸送をモデル化する提案された反応。 Ro、Ri、および Rlys は、それぞれ細胞表面、内部移行小胞、およびリソソーム内の受容体分子です。 α-syn は、これら 3 つの反応に異なる影響を与える可能性があります。補足シミュレーションファイルのシミュレーション結果を参照してください。 (C) プロットは、以下の反応の 180 分間のシミュレーション後の Ro と Rlys のパーセントを示します。 +α-syn の場合: k1 = 0.1 min−1、k−1 = 0.5 min−1、k2 = 0.005 min−1。 −α-syn の場合: k1 = 0.1 min−1、k−1 = 0.1 min−1、k2 = 0.005 min−1。 (D) プロットは、以下の反応の 180 分間のシミュレーション後の Ro と Rlys のパーセントを示します。 + α-syn の場合: k1 = 0.1 min−1、k−1 = 0.5 min−1、k2 = 0.005 min−1。 −α-syn の場合: k1 = 0.1 min−1、k−1 = 0.5 min−1、k2 = 0.02 min−1。

私たちは、シミュレーションを行うことで、α-syn が受容体輸送にどのような影響を与えるかを理解しようとしました。 TfR輸送に関するこの以前の研究に基づいて、対照細胞と比較したSNCA-KO細胞におけるL1CAMおよびTfRの減少の最も単純なモデルは、次の2つの反応です（図6Bにも示されています）。

ここで、Ro、Ri、および Rlys は、それぞれ細胞膜結合受容体、小胞内の内部移行受容体、およびリソソーム内の受容体です。我々は次の式を提案します。 (1) は、次のように溶液中で反応する小分子によってモデル化できます。

Espenson51 は、式 1 の反応に関連する微分方程式を解きました。 (2) そして、これらのソリューションを使用して、次の 2 つのシミュレーション (詳細については「材料と方法」を参照) で受容体輸送における α-syn の役割を調べました。

我々は、α-syn はエンドサイトーシス (Ro → Ri) を加速するよりも、内在化小胞と細胞膜との融合 (Ri → Ro) を加速する、すなわち k-1 > k1 であると規定しました。これは、細胞表面上の受容体の数を増加または維持するための明らかな方法と考えられます。したがって、このモデルでは、α-syn 発現の喪失により、内部移行した小胞が細胞膜と融合する速度が低下すると考えられます。この提案された α-syn の触媒作用をシミュレートするために、k-1 = 0.5 min−1 および k1 = 0.1 min−1 で 1 つのシミュレーションが実行されました。一方、α-syn 発現が存在しない他のシミュレーションは、k−1 = k1 = 0.1 min−1 で実行されました (これらのシミュレーションのそれぞれでは、k2 = 0.005 min−1)。これらのシミュレーションにより、α-syn を失うと細胞表面の受容体の数が減少し (72% → 33%)、リソソーム内の受容体の数が増加する (14% → 35%) ことが明らかになりました (図 6C)。

我々は、α-syn が内部移行小胞のリソソームへの移動 (Ri → Rlys) を阻害すると規定しました。したがって、α-syn 発現の喪失により、内部移行した小胞がリソソームに移行する速度が増加するということになります。 α-syn の提案された阻害作用をシミュレートするために、k2 = 0.005 min−1 で 1 つのシミュレーションが実行されました。一方、α-syn 発現が存在しない他のシミュレーションは、k2 = 0.02 min−1 で実行されました (これらのシミュレーションのそれぞれでは、k−1 = 0.5 min−1 および k1 = 0.1 min−1)。これらのシミュレーションは、α-syn を失うと細胞表面の受容体の数が減少し (72% → 47%)、リソソームに転送される受容体の数が増加する (14% → 44%) ことを示しています (図 6D)。全体として、我々のシミュレーションは、α-syn が 2 つの非常に異なる方法で細胞表面上の L1CAM および/または TfR 分子の数を変化させることができることを示しています。

このレポートの主な発見は、(i) 2 つのヒト皮膚黒色腫細胞株における α-syn 発現の喪失により、L1CAM、N-カドヘリン、および細胞運動性が大幅に低下するということです (図 1B、C、E、4A、C、G)。）。 (ii) α-syn 発現の喪失は、リソソームにおける L1CAM の分解を刺激します (図 3)。 (iii) SH-SY5Y 細胞における α-syn 発現の増加は、L1CAM と細胞運動性を増加させます (図 5A、B、D、E)。

L1CAM は 200 ～ 220 kDa の膜貫通型糖タンパク質で、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、神経突起伸長、遊走、接着、神経分化など、成人の神経系で無数の活動を行います (総説については 52、53、54 を参照)。。 L1CAM はシナプス可塑性に関与しているとされており 52、興味深いことに、α-syn はシナプス可塑性に関与しているとされています 40。 L1CAM は、黒色腫を含む神経外胚葉および神経堤起源のいくつかのがん 55 で上方制御されており、運動性に関与する腫瘍抗原として認識されています 41、42、43。エルンストら。 L1CAM をノックダウンすると、ヒト黒色腫の異種移植モデルで転移が大幅に減少することを発見しました 56。ここで我々は、SNCAをノックアウトすると、α-synを発現する対照細胞と比較してL1CAMのレベルが大幅に低下し、この接着タンパク質のレベルの低下が2つの黒色腫細胞株と1つの神経芽腫細胞における細胞運動性の低下に寄与している可能性があることを発見した。ライン。

シミュレーションは、α-synが小胞の輸送や原形質膜との融合を促進することによって、あるいは内部移行した小胞とリソソームの融合を阻害することによって、細胞表面上のL1CAMおよび/またはTfRの量を増加（または維持）できることを示しています（図1）。 .6）。理論的には、α-syn がエンドサイトーシスを阻害することで細胞表面の L1CAM および TfR の量を増加 (または維持) できる可能性がありますが、シヌクレインがエンドサイトーシスを促進することが示されていることを考慮すると 26、シヌクレインがエンドサイトーシスを阻害することによって作用するという考えは否定されました。明らかに、α-syn の発現がある細胞とない細胞における標識 TfR または標識 L1CAM の高分解能顕微鏡実験は、α-syn によって影響を受ける特定の反応を解読するために必要です。

Turriani ら 29 は最近、「PD と黒色腫の間には逆の分子的関連があり、PD において「有害な役割」であるタンパク質は、その機能が原発性および転移性黒色腫に重大な生存上の利益をもたらすため、黒色腫においては「有益な役割」であると示唆した。 Turriani は、α-syn29 のプリオン様オリゴマーを破壊する化合物 anle128b が、α-syn 誘発細胞死からニューロンを保護するが、対照的に、この化合物は WM983-B 黒色腫細胞株の大量細胞死を促進することを示しました。 WM983-B 細胞を anle138b で処理すると、凝集した α-syn のレベルが低下し、形態学的変化が生じ、ミトコンドリア膜電位とオートファジーが破壊されました。凝集したプリオン様形態の α-syn を溶解するとオートファジーが調節不全になると結論づけられ、これはこれらの異常な凝集形態の α-syn がオートファジーを促進することを示唆しています。私たちの研究とトゥリアーニの研究は、トゥリアーニが凝集したプリオン様形態のα-synを含む黒色腫細胞を、凝集体が溶解した同じ細胞と比較したという点で大きく異なります。一方、我々はα-synを発現する黒色腫細胞と発現しない黒色腫細胞を比較しました。一方、各研究は独立して、エンドリソソーム系、すなわちシヌクレインがリソソーム活性およびエンドリソソーム輸送にどのような影響を与えるかについて収束した。黒色腫におけるα-synの役割を解明するには、さらなる研究が必要です。

E-カドヘリンおよびN-カドヘリンは、Ca++依存性の細胞間接着膜貫通糖タンパク質です57。これら 2 つのタンパク質の保存された細胞質尾部は、異なる細胞シグナル伝達経路に関与するタンパク質のネットワークと相互作用します。 E-カドヘリンの外部ドメインは、隣接する細胞と同型二量体を形成します。 N-カドヘリンは構造的にはE-カドヘリンと似ていますが、その細胞質尾部は異なるタンパク質セットと相互作用します58。 EMT の特徴の 1 つは、N-カドヘリンの上方制御とそれに続く E-カドヘリンの下方制御です。我々の場合、2つの黒色腫細胞株におけるα-syn発現をノックアウトすると、N-カドヘリンのレベルは有意に減少しましたが、E-カドヘリンのレベルは減少しませんでした（図1A、C、E、4A、C、D）。あたかも、α-syn 発現の喪失が「EMT のような」現象を部分的に逆転させるかのようです。

最近、腎尿細管上皮細胞、コンディショナルノックアウトマウス、ヒト腎臓組織の臨床サンプルが、腎線維症における尿細管上皮α-synの役割を評価するために使用されました59。 Bozicらは、HK-2腎細胞を、腎上皮細胞の線維化シグナル伝達を媒介するトランスフォーミング成長因子β1（TGF-β1）で処理すると、上皮の表現型が変化し（敷石状形態の喪失）、E-カドヘリンが減少し、E-カドヘリンが増加することを発見した。 α平滑筋アクチン（α-SMA）とビメンチン。 TGF-β1 は、SNCA mRNA および α-syn 発現の用量依存的な減少を同時に誘導しました。上皮表現型の喪失とα-syn発現の調節不全が同時に起こることを考慮して、著者らは、α-synがin vitroでの腎近位尿細管上皮細胞（RPTEC）の上皮表現型の維持に役割を果たしていると仮説を立てた。彼らの仮説は、HK-2 細胞での α-syn の過剰発現が、TGF-β1 誘導性の α-SMA およびビメンチンの増加を in vitro で阻害するという発見によって裏付けられました。彼らはさらに、α-syn が in vitro で ERK1/2、Akt、および p38 の活性化を調節すること、TGF-β1 が MAPK-p38 軸の活性化を介して α-syn 発現を減少させること、および α-syn の喪失が線維化促進遺伝子を促進することを示しました。表現。私たちのグループは、α-syn が SH-SY5Y 細胞におけるストレス誘発性の p38 (および JNK および c-Jun) のリン酸化を阻害することを以前に示していました 60。彼らの結論は、α-syn が RPTEC の上皮表現型の維持に役割を果たしているということでした。もちろん、私たちの結果を Bozic の結果と比較することは困難です。なぜなら、私たちは非上皮由来の癌細胞を使用したのに対し、Bozic は非分裂腎上皮細胞を使用したからです。一方、これら 2 つの研究は、α-syn のジキル博士とハイド氏のような性質を明らかにしています。α-syn は腎細胞の上皮表現型をサポートするのに対し、α-syn は黒色腫および神経芽腫の「間葉様」表現型をサポートします。細胞。

要約すると、我々は、2 つのヒト皮膚黒色腫細胞株における α-syn 発現の喪失により、2 つの接着タンパク質、L1CAM と N-カドヘリンが大幅に減少し、それに付随して運動性が大幅に低下することを示しました。 α-syn は細胞膜への L1CAM の効率的な小胞輸送を促進し、ひいては浸潤、遊走、運動性を促進するため、α-syn は黒色腫 (およびおそらく神経芽腫) の生存を促進すると考えられます。

SK-MEL-28 細胞と SK-MEL-29 細胞は、それぞれ American Type Culture Collection (ATCC、バージニア州マナサス) と Sloan-Kettering Memorial Center から購入し、10% ウシ胎児血清 (FBS) を添加した DMEM で増殖させました。および 1% ペニシリン - ストレプトマイシン。 α-syn を過剰発現するヒト神経芽腫細胞株 SH-SY5Y (SH/αS) および対照 SH-SY5Y 細胞は、Joseph R Mazzulli 博士 (ノースウェスタン大学) からの寄贈であり、10% ウシ胎児を添加した Opti-MEM で増殖させました。血清 (FBS) および 1% ペニシリン - ストレプトマイシン。 SK-MEL-28 細胞については、α-syn CRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミド (Santa Cruz Biotechnology # sc-417273-NIC) を使用して、以前に説明したように 31、CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用して SK-MEL-29 細胞の SNCA を標的にしました。サイトメガロウイルス (CMV) プロモーター下でヒト α-syn を発現するレンチウイルス粒子 (Applied Biological Materials, Inc, Canada) を使用して、以前に記載されているように SK-MEL-28 KO 細胞で α-syn を再発現しました 31。プロテアソームおよびオートファジー阻害実験では、細胞を増殖培地中で 10 μM MG132 (Thermofisher Scientific、# M7449) で 6 時間、および 50 nM バフィロマイシン A1 (Millipore、# B1793) で 5 時間、それぞれ処理しました。細胞株は、MycoAlert® マイコプラズマ検出キット (# LT07-318) を使用して認証され、マイコプラズマ汚染について検査されました。

細胞溶解物の調製、SDS/PAGE、およびウェスタンブロット分析は、以前に記載されているように実行されました31。簡単に説明すると、細胞をRIPA溶解緩衝液(50 mM Tris HCl、pH 7.4、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、5 mM EDTA)中で溶解した。溶解物を遠心分離し (13,000 rpm/30 分/4 °C)、上清のタンパク質濃度を DC™ Protein Assay Kit (Bio-Rad #5 000 112) を使用して測定しました。等濃度のタンパク質（30 μg）を含むサンプルをジチオスレイトール（Invitrogen™ NuPAGE™ サンプル還元剤 # NP0004）で処理し、NuPAGE™ LDS サンプルバッファー（#NP000）中で 70℃ で 10 分間煮沸しました。ドデシル硫酸ナトリウム Bis-Tris ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) (NuPAGE™ 4 ～ 12%、Bis-Tris プレキャストポリアクリルアミドゲル、Invitrogen # NP0323BOX) によってタンパク質を分離し、その後 (Trans -Blot® Turbo™ Mini PVDF Transfer Pack、Bio-Rad # 1704156)。 0.1% (v/v) Tween-20 (PBST) を含むリン酸緩衝生理食塩水中の 5% ブロット (G-Biosciences Blot-Quikblocker # 786-011) でメンブレンを室温で 1 時間ブロッキングした後、メンブレンは多くの場合、をストリップに切断し、個々のストリップを指定の一次抗体と 4 °C で一晩ハイブリダイズさせ、続いてそれぞれのホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) コンジュゲートとインキュベートしました。免疫反応性バンドは強化化学発光基質 (Clarity™ Western ECL Substrate、Bio-Rad #170-5060) を使用して視覚化し、画像は Biorad Chemidoc-MP イメージングシステムを使用して取得しました。対象タンパク質のバンド強度を定量化し、ImageJ ソフトウェアを使用してハウスキーピングタンパク質 α-チューブリンに対して正規化した相対タンパク質レベルとして表しました。抗体 (希釈あり) を表 2 に示します。

表１の細胞株の浸潤および転移の可能性は、孔径８μｍのボイデンチャンバー（Ｃｏｓｔａｒ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．＃ＣＬ３４６４）を使用するトランスウェルアッセイによって決定した。簡単に説明すると、細胞を無血清DMEMに懸濁し、マトリゲル(Corning, Inc. #356234)あり(浸潤アッセイ)およびなし(遊走アッセイ)の心尖チャンバーに播種し、10% FBSを含む完全培地750μlを添加した。トランスウェルの下部チャンバーに24時間放置した。 37℃で24時間インキュベートした後、細胞は下面を通って移動/侵入し、4％パラホルムアルデヒドで5分間固定し、その後0.1％クリスタルバイオレットで10分間染色して細胞を視覚化しました。トランスウェルの上部チャンバー内の細胞を綿棒で注意深く除去し、オリンパス倒立光学顕微鏡を使用してトランスウェルの下部チャンバー内の細胞の画像を撮影した。

コントロールおよびSNCA-KO黒色腫細胞株の運動性は、細胞が経路から金を除去する能力を追跡することによって測定されました38。このために、6 ウェルプレートを 2 ml の 1% BSA でコーティングし、加湿 CO2 インキュベーター内で 37 °C で 3 時間インキュベートし、無水エタノールで洗浄しました。次に、ウェルを次のように調製した金コロイド溶液の均一層でコーティングしました。合計 3.85 mL の滅菌 H2O、630 μL の 14.5 mM AuHCl4、および 2.1 ml の 36.5 mM Na2CO3 を 100 °C で沸騰させました。 5分後、0.1%のホルムアルデヒドを添加。金コロイドでコーティングしたプレートを CO2 インキュベーター内で 37 °C で 24 時間インキュベートし、10% FBS を含む完全培地に最終細胞数 1 × 103 細胞/ウェルで細胞を播種しました。 24 時間後、オリンパス倒立光学顕微鏡を使用してウェルを画像化し、ImageJ ソフトウェアを使用してトラックを定量化しました。

製造業者の指示に従って、EZNAカラムベースの全RNAキット(Omega BioTek)を使用して、細胞から全RNAを抽出した。抽出された RNA の濃度と品質は、NanoDrop 分光光度計 (Thermo Scientific) で測定されました。 iScript cDNA合成キット(Bio-Rad)を製造業者のプロトコールに従って使用することにより、各サンプルからの全精製RNA(1μg)からcDNAを合成した。 qPCR は、Applied Biosystems TaqMan™ Gene Expression Assays を使用し、SNCA (Hs00240906)、L1CAM (Hs01109748)、GAPDH (Hs02786624) のプライマー/プローブセットを使用して実行されました。 ΔΔCT法を採用して、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して正規化された各mRNAの相対量を計算しました。データは比較 CT 法を使用して分析され、倍数変化は Bio-Rad CFX384 Touch Real-Time PCR System およびソフトウェア (Bio-Rad) を使用する 2-ΔΔCT 法を使用して計算されました。結果は、相対log2 FC (倍率変化) 相対値として表されました。

Espenson51 は、式 1 の反応に関連する微分方程式を解きました。 (2) 特別な場合 [A](t = 0) = [A]o および [B]o = [C]o = 0。3 つの種の解は次のとおりです。

ここで、λ2 = 1/2 (p + q) および λ3 = 1/2(p − q) (p = k1 + k−1 + k2 および q = (p2 – 4 k1k2)1/2)。 Eqを使用しました。 (3)、(4)、(5) により、それぞれ [Ro](t)、[Ri](t)、[Rlys](t) の値が求められます。

シミュレーションは以下のように行った。 (i) 方程式。 (3)、(4)、および (5) は EXCEL ファイルに入力されました (Supplementary Simulations.xls を参照)。 (ii) 速度定数 k1、k-1、および k2 の値が選択されました。 (iii) t = 0 では、すべての受容体は [Ro] = 1.0 μM および [Ri] = [Rlys] = 0 で細胞膜上にありました。 (iv) シミュレーションは 180 分間行われました。 (v) シミュレーション中にタンパク質合成は発生しませんでした。 (vi) これらのシミュレーションの基礎は、α-syn が膜に結合する能力により、3 つの速度定数のいずれか 1 つの大きさに影響を与える可能性があるということでした。 [Ro](t = 180 分) および [Rlys](t = 180 分) の値を図 6C、D にプロットします。 [Rlys](t = 180 分) の値は負の符号でプロットされています。リソソームに入ると分解されます。

仮説検定方法には、複数のグループを対照群と比較する場合のダネット事後検定による一元配置分散分析 (ANOVA) が含まれます (図 1 E、G、2、3C、D、および 4C ～ E、G)。 2 つのグループを比較する場合の片側スチューデント t 検定 (図 5 B、C、E)、および DMSO 対 baf 処理サンプルを比較する場合の片側スチューデント t 検定 (図 3B)。すべてのデータは、GraphPad Prism (バージョン 6) ソフトウェアを使用して分析されました。すべての値は、少なくとも 3 回の独立した実験 (生物学的反復) の平均 ± 標準偏差 (sd) として表されました。 < 0.05 の P 値は有意であるとみなされました。

この研究からのすべてのデータは、記事とその補足情報に含まれています。

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この研究は、ファイスト・ワイラーがんセンターとシュリーブポートのLSU健康科学センター学長からSNWまでの資金によって支援されました。

Nithya Gajendran と Santhanasabapathy Rajasekaran の著者も同様に貢献しました。

ルイジアナ州立大学健康科学センター、生化学および分子生物学部、米国シュリーブポート

ニティア・ガジェンドラン、サンタナサバパシー・ラジャセカラン、ステファン・N. ウィット

ファイストワイラーがんセンター、ルイジアナ州立大学ヘルスシュリーブポート、米国シュリーブポート

ステファン・N・ウィット

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NG と SR は、研究の構想、実験、データ分析、解釈、改訂に等しく貢献しました。 SNW は研究の構想に貢献し、研究の監督、データ分析、原稿の執筆と編集を行いました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ステファン N. ウィットへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Gajendran, N.、Rajasekaran, S. & Witt, SN 黒色腫細胞のα-シヌクレインをノックアウトすると、L1CAM が下方制御され、運動性が低下します。 Sci Rep 13、9243 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36451-3

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受信日: 2023 年 1 月 16 日

受理日: 2023 年 6 月 3 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36451-3

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